СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПИДОВ Российский патент 1994 года по МПК C12P7/64 C12N1/14 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробному синтезу фармакологически активных веществ.

Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты, в частности γ-линоленовая кислота, являются биологически активными вещества и используются в медицине, например, для предупреждения атеросклероза, а также как противовоспалительные, антиаллергические средства . В последнее время липиды, содержащие γ-линоленовую кислоту, находят широкое применение также в косметологии .

Каротиноиды - биологически активные соединения, они входят в состав препаратов, обладающих репаративной активностью .

Наряду с лечебным действием каротиноиды обладают антиоксидантным действием по отношению к ненасыщенным липидам , поэтому присутствие их в липидах стабилизирует полиненасыщенные жирные кислоты, в данном случае предотвращает перекисное окисление γ-линоленовой кислоты.

Представляет большой интерес разработка способа получения липидов, содержащих так γ-линоленовую кислоту, так и каротиноиды.

Известен способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты и каротиноиды, с помощью культуры Mortierella .

Недостатком этого способа является недостаточно высокое содержание γ-линоленовой кислоты и каротиноидов в липидах (в 8% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 1800 мкг/г липидов каротиноидов).

Известен способ получения каротиноидов с помощью культуры Вl.trispora, его липиды содержат 20000 мкг/г липидов каротиноидов, но всего лишь до 12% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот .

Известен способ получения комплекса биологически активных веществ липидной природы с помощью штамма дрожжей Rhodotorula glutinis . В комплексе липидов содержится до 40% незаменимых жирных кислот от суммы жирных кислот и 1200-1250 мкг каротиноидов на 1 г липидов. Однако в составе жирных кислот отсутствует γ -линоленовая кислота. Данный комплекс липидов предлагается использовать в сельском хозяйстве качестве добавки в корм животных.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ получения биологически активных липидов, содержащих γ-линоленовую кислоту, с помощью гриба Мuсor ИНМИ . Культуру гриба выращивают в течение 72 ч при температуре 28±1 ^оС в двухлитровых колбах с рабочим объемом 300 мл. Состав среды, г/л Н₂О: глюкоза 30; мочевина 1 г; К₂НРО₄1 г; NaCl 0,5 г; MgSO₄ ˙7H₂O 0,5 г; FeSO₄ ˙7Н₂О 0,01 г; СаСl₂ 0,02 г; ZnSO₄ ˙7H₂O 0,01 г; дрожжевой экстракт 0,5; витамин В₆ 2 мг; биотин 0,02 мг; Н₂О 1 л, рН 6,5, при аэрации 1,6-1,8 О₂/л/ч. При этом получают 29% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот при выходе липидов 12,0 г на 100 г использованной глюкозы, каротиноидов 1500-2000 мкг/г липидов.

Недостатком данного способа является низкое содержание каротиноидов в липидах, в результате чего они недостаточно эффективны при изготовлении ранозаживляющих и других лекарственных средств.

Цель изобретения - увеличение содержания каротиноидов в комплексе липидов, содержащих γ-линоленовую кислоту.

Это достигается тем, что гриб Mucor lusitanicus ИНМИ (депонирован в ВКМ под номером F - 306 Д) выращивают на среде следующего состава, г/л Н₂О): глюкоза 60±0,01; ацетат натрия 3-5; мочевина 2±0,01; К₂ НРО₄ 1 ± 0,01; NаСl 0,5±0,01; MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,5 ± 0,01; ZnSO₄ ˙ 7H₂O 0,01± 0,001; FeSO₄ ˙ 7H₂O 0,01 ± 0,001; СuSO₄ ˙7Н₂О 0,01±0,001; СаСl₂ 0,02±0,001; KMnO₄ 0,015-0,030; витамин В₁ 0,002; витамин В₆ 0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5±0,01. Культивирование проводят в течение 72 ч при температуре 26-28^оС, аэрации 1,6-1,8 О₂/л/ч, рН 4,5-5,5.

Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием и лиофилизируют. Липиды извлекают из лиофилизированной биомассы последовательной экстракцией этанолом и гексанолом (соотношение биомассы и растворителя 1:15). Жирнокислотный состав липидов определяют методом газожидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом. Каротиноиды определяют спектрофотометрически при длине волны 451±2 нм.

В результате получают смесь липидов, содержащую 28-30% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 5600-6500 мкг/г липидов каротиноидов, при выходе липидов 11-12 г на 100 г использованной глюкозы.

Отличительным признаком данного способа является то, что среда дополнительно содержит, г/л: ацетат натрия 3-5; КМnО₄ 0,015-0,03; СuSO₄˙7H₂O 0,01± 0,001; витамин В₁ 0,002, а выращивание ведут при рН 4,5-5,5.

Добавление КМnО₄, являющегося сильным окислителем, стимулирует синтез каротиноидов, не оказывая влияния на рост гриба и не подавляя синтез γ-линоленовой кислоты. Добавление ацетата натрия в концентрации от 3 до 5 г/л и витамина В₁ способствует синтезу липидов и каротиноидов. При повышении концентрации ацетата натрия больше 5 г/л снижается содержание γ-линоленовой кислоты в липидах. СuSO₄ x x 7Н₂О стимулирует синтез γ-линоленовой кислоты.

П р и м е р 1. Культуру Мucor lusitanicus ИНМИ выращивают в течение 72 ч в колбах на 750 мл, содержащих 100 мл среды, при температуре 28^оС на качалке при аэрации 1,8 О₂/л/ч. Состав среды, г/л Н₂О: глюкоза 60,0; ацетат натрия 3,0; мочевина 2,0; NaCl 0,5; К₂НРО₄ 1,0; MgSO₄ ˙7Н₂О 0,5; ZnSO₄ x 7H₂O 0,01; FeSО₄ ˙7Н₂О 0,01; СаСl₂ 0,02; КМnО₄ 0,015; CuSO₄ ˙ 7H₂O 0,01; витамин В₁ 0,002; витамин В₆ 0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5; рН среды 5,5.

В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 10⁶кл/мл. Споровый материал выращивают на агаризо- ванной среде Чапека.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости, лиофилизируют. Лиофилизированную биомассу последовательно экстрагируют этанолом и гексаном. Выход липидов составляет 11 г на 100 г использованной глюкозы, при этом содержание γ-линоленовой кислоты - 30% от суммы жирных кислот, каротиноидов - 5600 мкг/г липидов.

П р и м е р 2. Культуру Mucor lusitanicus ИНМИ выращивают в течение 72 ч при температуре 26^оС, аэрации 1,8 О₂/л/ч, на среде следующего состава, г/л Н₂О: глюкоза 60,0; ацетат натрия 5,0; мочевина 2,0; NaCl 0,5; К₂НРО₄ 1,0; МgSО₄ ˙7Н₂О 0,5; ZnSО₄ ˙7Н₂О 0,1; СuSO₄ ˙7Н₂О 0,01; FeSO₄ ˙7H₂O 0,01; CaCl₂ 0,02; КMnO₄ 0,03; витамин В1 0,002; витамин В₆0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5, рН среды 4,0.

В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 10⁶кл/мл. Споровый материал выращивают на агаризо- ванной среде Чапека.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости, лиофилизируют. Лиофилизированную биомассу последовательно экстрагируют этанолом и гексаном. Выход липидов составляет 12,0 г на 100 г использованной глюкозы, γ-линоленовой кислоты - 28% от суммы жирных кислот, каротиноидов - 6500 мкг/г липидов.

Были изучены ранозаживляющие и противоожоговые свойства комплекса липидов гриба Mucor lusitanicus ИНМИ, полученного данным способом, который содержит γ-линоленовую кислоту и каротиноиды. Исследования проводились на кафедре оперативной хирургии 1-го лечебного факультета Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Обнаружено, что присутствие в липидах каротиноидов в значительной степени усиливает лечебное действие используемых липидов (таблица). Как видно из таблицы комплекс липидов, содержащий γ-линолевую кислоту и каротиноиды, обладает более эффективным ранозаживляющим действием, чем липиды с γ-линоленовой кислотой без каротиноидов, облепиховое масло, синтомициновая эмульсия и препарат "Биополиен", разработанный в ММА им. И.М.Сеченова.

Предполагается разработка лабораторного регламента на получение лекарственных форм для наружного применения на основе липидов, полученных предложенным способом, на кафедре заводской технологии ГЛС ММА им. И.И.Сеченова.

Использование: биотехнология, микробный синтез фармакологически активных веществ. Сущность изобретения: получение комплекса липидов, содержащих γ -линоленовую кислоту. Способ предусматривает выращивание гриба Mucor lusitanicus ИНМИ при глубинном культивировании в условиях непрерывной аэрации на питательной среде, содержащей углеводородный источник углерода и неорганический источник азота. Среда дополнительно содержит, г/л: ацетат натрия 3 - 5; KMnO₄ 0,015 - 0,030; CuSO₄·7H₂O 0,01 - 0,0001; витамин B 0,002, выращивание ведут при pH 4,5 - 5,5. За 72 ч на 100 г использованной глюкозы синтезируется 12 г липидов, которые содержат 28% γ -линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 6500 мкг каротиноидов на 1 г липидов. 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПИДОВ, содержащих γ -линоленовую кислоту и каротиноиды, предусматривающий выращивание гриба Mucor lusitanicus BKMF-306 D на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора, микроэлементы и витамины, при аэрации, отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания каротиноидов в комплексе липидов, используют среду, дополнительно содержащую, г/л:
Ацетат натрия 3 - 5
КМпО₄ 0,015 - 0,03
CuSO₄ · 7 H₂O 0,01 ± 0,001
Витамин B₁ 0,002,
а выращивание ведут при pH 4,5 - 5,5.