СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/14 C12P7/64 C12R1/645 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения липидной фракции из биомассы мицелиальных грибов для использования ее в дальнейшем преимущественно в качестве биодизельного топлива при производстве лекарственных препаратов, в пищевой промышленности и т.д.

В последнее десятилетие в качестве продуцентов липидов для биодизеля используют автотрофные и гетеротрофные водоросли, бактерии, дрожжи и мицелиальные грибы

Лучше всего требованиям современных биотехнологических производств липидов соответствуют мицелиальные грибы: эти организмы обладают одной из наибольших скоростей накопления биомассы.

- Процесс культивирования грибов лучше отработан с биотехнологической точки зрения, нежели выращивание водорослей, и способен к большему масштабированию, чем выращивание растений.

- Выход продукта не зависит от сезонных колебаний температуры и величины посевных площадей, возможно круглогодичное получение продукта.

- Имеется возможность варьирования ацильных цепей липидов при помощи изменения параметров среды и других факторов.

- Наиболее олеогенные виды, в частности мукоровые грибы, не образуют в составе липидов полиненасыщенные жирные кислоты, и в данном случае преобладающими жирными кислотами являются пальмитиновая, линолевая и олеиновая.

- Остающиеся после извлечения липидов из мицелиальных грибов клеточные стенки содержат полисахариды, в частности хитин, хитозан, гетерополисахариды.

Известен способ получения липидов с использованием мицелиальных (мукоровых) грибов (Авторское свидетельство 1613492, МПК C12P 7/64, публ. 1990 г.), включающий глубинное культивирование микроскопического гриба Cunninghamella japonica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сточные воды производства оливкового масла, после выращивания спор гриба на сусло-агаре в течение 7 суток.

Недостатком этого способа является то, что получают плохо очищенные липиды, которые нельзя использовать как биодизельное топливо и при получении лекарственных препаратов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения липидов (Прикладная биохимия и микробиология. Сергеева Я.Э. и др. Липиды мицелиальных грибов как основа получения биодизельного топлива, 2008, Т. 44, №5, с.576-586), включающий использование в качестве посевного материала 7-суточные споры штаммов мукоровых грибов рода Cunninghamella, выращенные на сусло-агаре, культивирование на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 5% глюкозы, в качестве источника азота NH₄NO₃ - 0,12%, дрожжевой экстракт - 0,1%, КH₂PO₄ - 0,1%, MgSO₄×7H₂O - 0,025%.

К навеске влажной биомассы гриба (влагосодержание 80-85%) добавляли смесь растворителей хлороформ-метанол и гомогенизировали в течение 2-5 минут при комнатной температуре. Далее полученный гомогенат перемешивали на магнитной мешалке в течение 20 минут, отфильтровывали и твердый остаток подвергали повторной экстракции дважды. К объединенному фильтрату добавляли воду. Водно-метанольную и хлороформенную фазу разделяли путем отстаивания в делительной воронке. Хлороформенный слой, содержащий липиды, сушили над слоем безводного сульфата натрия, концентрировали на роторном испарителе и доводили до постоянного веса.

Недостатками данного способа является нестабильность ферментации, недостаточно высокая всхожесть спор продуцента, отсутствие синхронности в их прорастании, что отрицательно влияет на выход липидов. Кроме того, извлечение липидов из влажной биомассы уменьшает их выход.

Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, увеличение выхода и получение более очищенных липидов, уменьшение их стоимости, возможность вторичного использования отходов этого производства за счет оптимизации процесса путем синхронизации и увеличения скорости прорастания спор посевного материала, стабильности ферментации и сокращения их срока.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения липидов, включающем выращивание спор мицелиальных грибов рода Cunninghamella на сусло-агаре при температуре 27-28°С, смыв спор и выдержку 20-30 минут при слабом встряхивании, использование смытых спор как посевного материала, который ферментируют на питательной среде, содержащей глюкозу, нитрат аммония, сульфат магния семиводный, дигидрофосфат калия, дрожжевой экстракт, с последующим отделением биомассы и извлечением липидов предложено при выращивании спор в слой сусло-агара добавлять 0,2% трегалозы. При этом выращивание ведут в течение 5-6 суток, а собранные споры выдерживают в стерильной водопроводной воде. Процесс ферментации осуществляют в течение 90-96 часов при температуре 29±0,5°С, причем в питательную среду вносят 0,1-0,2% D-глюкозамина или 0,11-0,15% N-ацетил-D-глюкозамина, а полученную биомассу после отделения лиофилизируют. Извлечение липидов осуществляют путем встряхивания на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1.

Способ осуществляется следующим образом.

При получении липидов можно использовать штаммы грибов семейства Cunninghamellaceae: C.japonica BKM F-1204 (-), C.echinulata BKM F-470 (-), BKM F-626 (-), ВКМ F-657 (-), C.homothallica BKM F-930. Штаммы С.japonica выращивают в пробирках на скошенном слое сусло-агара с добавлением 0,2% трегалозы в течение 5-6 суток при температуре 27-28°С, смывают споры стерильной водопроводной водой и получают посевной материал. Такие споры содержат наибольшее количество липидов (до 6%), и выросший из них мицелий образует наибольшее количество липидов - около 50%. Полученные споры инкубируют в течение 20-30 минут на качалке. Такая предварительная инкубация спорового материала обусловлена тем, что на голодной среде, в данном случае воде, происходит более быстрое прорастание спор и образование ростовых трубок, что способствует сокращению первой ростовой фазы и ускоряет дальнейшее образование липидов.

Далее для ферментации посевные споры в количестве 10⁶ клеток в 1 мл среды вносят в питательную среду. Среда содержит в мас.%: глюкозу - 5, нитрат аммония - 0,12, сульфат магния семиводный - 0,025, дигидрофосфат калия - 0,1, дрожжевой экстракт - 0,1, D-глюкозамин - 0,1-0,2% или N-ацетил-D-глюкозамин - 0,11-0,15%. Процесс ферментации ведут в течение 90-96 часов. Температуру в термостате поддерживают на уровне 29±0,5°С.

Полученную биомассу после отделения лиофилизируют в лиофильной сушке по стандартной методике и, при необходимости, измельчают. Извлечение липидов проводят путем встряхивания на качалке (или мешалке) лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1, полученного опытным путем. Выход липидов составляет до 54%.

Примеры конкретного выполнения способа получения липидов.

Пример 1.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что штамм Cunninghamella japonica BKM F-1204(-) выращивают для получения посевного материала в пробирках на скошенном слое сусло-агара с добавлением 0,2% трегалозы в течение 5 суток при температуре 27°С. Споры смывают с агаризованной среды водопроводной стерильной водой и инкубируют в течение 30 минут на качалке при той же температуре. Далее посевные споры вносят в ферментационную среду предлагаемого состава с добавлением 0,1% D-глюкозамина, ферментацию ведут в течение 96 часов. Полученную биомассу лиофилизируют. Извлечение липидов осуществляют путем встряхивания на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1. Выход липидов составил 53,17%.

Пример 2.

То же, что в примере 1, но используют 0,2% D-глюкозамина. Выход липидов составляет 55,20%.

Пример 3.

То же, что в примере 1, но вместо 0,1% D-глюкозамина вносили 0,11% N-ацетил-D-глюкозамина. Выход липидов составил 52,80%.

Пример 4.

То же, что в примере 3, но используют 0,15% N-ацетил-D-глюкозамина. Выход липидов составил 54,60%.

Пример 5. То же, что в примере 1, но используют штамм С.echinulata ВКМ F-470(-). Выход липидов составляет 49,00%.

Пример 6.

То же, что в примере 1, но используют штамм С.echinulata BKM F-626 (-). Выход липидов составляет 48,50%.

Пример 7.

То же, что в примере 1, но используют штамм С.echinulata BKM F-657(-). Выход липидов составляет 49,80%.

Пример 8.

То же, что в примере 1, но используют штамм C.homothallica BKM F-930. Выход липидов составляет 47,00%.

Предлагаемый способ позволяет повысить выход липидов, достичь их более высокой очистки и понизить их стоимость за счет активации и синхронизации прорастания посевного материала, сокращения и стандартизации процесса ферментации.

Изобретение относится к области биотехнологии. Выращивают споры мицелиальных грибов рода Cunninghamella на сусло-агаре при температуре 27-28°С в течение 5-6 суток. В слой сусло-агара дополнительно добавляют 0,2% трегалозы. Смывают споры и выдерживают 20-30 минут в стерильной водопроводной воде при слабом встряхивании. Смытые споры в качестве посевного материала ферментируют в течение 90-96 часов при температуре 29±0,5°С на питательной среде, содержащей глюкозу, нитрат аммония, сульфат магния семиводный, дигидрофосфат калия, дрожжевой экстракт и 0,1-0,2% D-глюкозамина или 0,11-0,15% N-ацетил-В-глюкозамина. Отделяют полученную биомассу и лиофилизируют. Извлекают липиды встряхиванием на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1. Предлагаемый способ позволяет повысить выход липидов до 54%. 8 пр.

Способ получения липидов, включающий выращивание спор мицелиальных грибов рода Cunninghamella на сусло-агаре при температуре 27-28°С, смыв спор и выдержку 20-30 мин при слабом встряхивании, использование смытых спор как посевного материала, который ферментируют на питательной среде, содержащей глюкозу, нитрат аммония, сульфат магния семиводный, дигидрофосфат калия, дрожжевой экстракт, с последующим отделением биомассы и извлечением липидов, отличающийся тем, что при выращивании спор в слой сусло-агара добавляют 0,2% трегалозы, выращивание ведут в течение 5-6 суток, собранные споры выдерживают в стерильной водопроводной воде, а процесс ферментации осуществляют в течение 90-96 ч при температуре 29±0,5°С, причем в питательную среду вносят 0,1-0,2% D-глюкозамина или 0,11-0,15% N-ацетил-D-глюкозамина, а полученную биомассу после отделения лиофилизируют, и извлечение липидов осуществляют путем встряхивания на качалке лиофилизированной биомассы со смесью хлороформа и этилового спирта в соотношении 2:1.