Способ получения иммуносорбента Советский патент 1984 года по МПК A61K39/12 A61K47/00 

Изобретение относится к медицинско промышленности, а именно к имуннохи мии, и мсшет быть использовано, для выделения чистых специфических анти тел методом аффинной хроматографии. При иммобилизации антигена - ви.руса гриппа на нерастворимом носите ле образуется специфический иммуносорбент, который должен обладать следующими свойствами: способностью адсорбировать антитела из смеси ком понентов, освобождать дсорбиро- . ванные антитела из комплекса со спе цифическим сорбентом количественно при высокой степени их очистки от сопутствующих аллергенов, обладать высокой сорбционной емкостью по специфическим антителам, обладать подходящими механическими свойствами, позволяющими фильтровать и напо нять колонки, быть нечувствительным к микробному воздействию.и к изменениям рН. Известен способ получения иммуно сорбентов для вьщеления антител, за ключанлцийся в обработке полисахарид ного носителя: целлюотозы, сефадекес сефарозы, производных целлюлозы -2амино-4,6-дихлор-симм-триазином, раствором карбоната натрия и соляной кислоты с последукщей промывкой водно-ацетоновой смесью и О,1 М фосфатным буфером и связыванием антигена за счет реакции с аминогруппой lj , Недостатками известного способа являются сложность и длительность получения иммуносорбента, а также использование в качестве матрицы ор ганических носителей, которые механически непрочны, подвергаются де ствию микроорганизмов, обладаютструктурной лабильностью, чувствительны к изменениям рН. Известен способ получения иммуно сорбентов путем взаимодействия неорганической матрицы и пористого стекла с -аминопропилтриэтоксисила ном, заключающийся во взаимодействи очищенного путем нагревания в течение 3 ч в О,1 М HNOj,.высушенного при 90°С и нагретого до 700°С в течение 3 ч в присутствии кислорода, стекла с 10%-ным раствором Y -аминопропилтриэтоксисил.аном в метиловом спирте или толусхпе, в последующем превращении алкиламино-силанстекла в ариламинопроизводные с помощью реакции с rf-нитробензоилхлоридом, восстановлении нитрогрупп N и взаимодействии с антигеном , Недостатками данного спос.оба являются сложность и длительность получения иммуносорбента, необходимость дополнительной активации после процесса силанизации поверхности стекла, применение органических растворителей: метилового спирта, толуола. Наиболее близким к предлагаемому по достигаемому результату является способ получения иммуносорбента для выделения противогриппозньк антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена - вируса гриппа, заключающийся в следующем: носитель агарозу активируют бромцианом и затем проводят сорбцию антигена 3J . Недостатками способа являются низкая сорбционная емкость иммуносорбента по антигену 37-39%, низкий выход антител при десорбции 1 М и ЗМЦаЛ - 22-23% при их низкой удельной активности, т.е. очистке 0,270,45 (удельная активность - это отношение титра вьщеленных антител, к концентрации белка). Возможность увеличения выхода антител за счет предварительной обработки кислыми буферными растворами приводит к усложнению технологии выделения антител, при этом наблюдается значительнов количество сопутствукщего выделенным антителам белка, т.е. низкая степень очистки - удельная активность. 0,45..Цель изобретения - повышение сорбционной емкости по антигену. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу .получения иммуносорбента для выделения противогриппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена - вируса гриппа, в качестве носителя используют макропористое стекло, которое подвергают модификации обработкой парами винилтрихлорсилана в токе инертного газа при 170-180 С и гидролизом полученного, продукта парами воды, Обычно обработку парами винилтрилорсилана ведут 20-30 мин. Способ осуществляют следукяцим обазом. Макропористое стекло обрабатывают токе инертного газа парами винилтрихлорсилана на 20-30 мин при 170180 С в реакторе проточного типа с последующим удалением непрореагирова шего винилтрихлорсилана и образовавш гося хлористого водорода, а затем гидролизом хлор-иона, входящего в со тав продукта, парами воды и обработкой вирусом гриппа. Иммобилизацию вируса проводят путем взаимодействия сорбента с противогриппозной вакциной. Адсорбцию антител проводят из иммунной сыворот ки в статических условиях бач-методо на электромеханической мешалке со скоростью вращения 11 об/мин в объеме сыворотки 2 мл при 25 С и времени контакта 30 мин трижды. Отмывку анти тел проводят 0,1 М фосфатным буфером рН 7,2 с 0,15 МНаСе порциями по 10 м в течение 15 мин до полного удале- . ния антител в отбираемых фракциях. Титр антител определяют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). : Десорбцию антител проводят т-рис+НСЕ рН 9 и 1 М и ЗМ kaZ) буферными растворами порциями по 10 мл в течение 15 мин до полного удаления антител в отбираемых фракциях. В результате обработки образуется иммуносорбент, устойчивый в интервале рН 2,О-9,0.Вируссодержащий сорбент стабилен и может повторно использоваться в широких пределах диссоциации без заметной потери способности связывать антитела. Количество винильных групп в по.верхностном модифицированном слое сорбента О,12-0,14 мг-экв/г. Количество химически адсорбированного ан тигена - вируса гриппа 15260 ГАЕ/г сорбента (ГАЕ-произведение обратного титра на объем пробы),что составляет .62% от общего количества антигена. Выпи проведены опыты по проверке специфичности полученного иммуносор, бента. В опытах использовали штамм вируса гриппа А-385 (.J- Для этого использовали иммунную сыворотку к вирусу Х-54 (Н,N,), Биологическую активность антител определяли по реакции непрямой гемагглютинации (РИГА с использованием микротитратора Така чи.Получ-енные результаты показали, что на данном иммуносорбенте неспецифические антитела не сорбировались т.е. наблюдалась только биоспецифическая сорбция антител. Выбранный интервал температур 170ШО с обработки носителя парами винилтрихлорсилана обусловлен тем, что при этой температуре поверхность стекла наиболее гидроксилирована. Увеличение температуры приводит к дегидратации ОН-групп на поверхности, а следовательно, к снижению количества вступивших в реакцию РТХС групп, т.е. уменьшению модификатора в поверхностном слое и снижению активности. Уменьшение температуры обработки приводит к замедлению взаимодействия ВТХС с гидроксильными группами, а также не исключает возможности присутствия молекулярно-связанной воды, которая при взаимодействии с ВХТС может привести к частичному нековалентному связыванию модификатора с поверхностью носителя, т.е. к снижению устойчивости сорбента. Выбранное время обработки носителя парами ВТХС 20-30 мин обусловлено тем, что 20 мин- это то время, при„ котором все гидроксильные группы поверхности вступают во взаимодействие с парами ВТХС. Увеличение времени обработки выше 30 мин нецелесообразно, так как поступающие пары, не реагируя, выводятся из реактора.. Уменьшение времени контакта снижает количество модификатора в поверхностном слое, что снижает количество активных центров, снижает емкость сорбента по антигену - вирусу гриппа. Пример 1. Навеску пористого стекла 1 г размером 2000 А и удельной поверхностью 25 помещают в реактор проточного типа и в токе сухого инертного газа обрабатывают парами винилтрихлорсилана (ВТХС) при 170 С 20 мин с последующим удалением непрореагировавшего ВТХС и образовавшегося НС, затем проводят гидролиз хлор-иона, входящего в бостав продукта, парами воды и далее проводят сорбцию вируса гриппа в объеме 2 мп противогриппозной вакцины в течение 1 ч при 25°C полученный иммуносорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2. Удаление непрореагировавщего ВТХС й образовавшегося НС, а также гидрдлиз хлор-иона контролируют по покраснению индикаторной бумажки, смоченной метилора нжем. Конец - отсутствие покраснения. Примерное время удаления 3-5 мин, гидролиз 5-7 мин. Количество винильных групп на сорбенте 0,12 мг-экв/г. Емкость сорбента по русу гриппа штамм А-385 (. 15264 ГАЕ/г сорбента, что соста-вляе 62,1%. Затем навеску сорбента 0,5 г с иммобилизованным вирусом гриппа п мещают в объем 2 мл иммунной сыворо ки и проводят адсорбцию антител до попного насыщения сорбента - 3 раза по 30 мин при , отмывают фоновы буфером и проводят десорбцию по опи санной методике. В качестве элюирую щих растворов ислользуют трис+НСР рН 9,0 с 1 Ми 3MNaJ . Количество сорбированных (вьщеленньк) антител составляет 50%. Количество белка, сопутствующего снятым антителам, 2., О мкг/мп, общий титр снятых антител 1:80. Удельная активность вьщеленньк антител 40. П .р и W ер 2. То же, что в при мере 1, но навеску стекла обрабатывают парами ВТХС при 30 мин. Емкость сорбента по вирусу гриппа антигену - 15258 ГАЕ/г сорбента, чт составляет 62%. Количество десорбированных антител 47,8%. Количество белка, сопутствующего вьщеденным антителам, 1,9.мкг/мл. Общий титр снятых антител 1:62. Удельная активность антител 32,6. Пример 3. То же, что в примере 1, но навеску стекла обрабатывают парами ВТХС при 180°С 20 мин. Емкость сорбента по антигену Т5289 ГАЕ/Г сорбента, что составляет 62,2%. Количество десорбированны антител 51,5%. Общий титр снятых ан тел 1:88. Количество белка, сопутст вующего антителам, 2,1%. Удельная активность антител 41,9. Данные поСравнению полученных результатов с прототипом, а также с контролем, где был взят сорбент, модифицированный группами без иммобилизованного вируса гриппа, представлены в таблице. 1 Как видно из таблицы, количество адсорбированного антигена - вируса гриппа в 1,6 раза вьппе, чем в прототипе, при этом количество снятых антител в 2,2 раза вьппе, чем в. прототипе, в случае выделения антител без дополнительной ,обработки сорбента с комплексом антиген-антитело. Степень очистки вьщелнемых антител от сопутствующего белка в 93-120 раз выше, чем в прототипе, независимо от способа элюцииантител с поверхности иммуносорбента. . . Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет пригог товить иммуносорбент на основе пористого стекла, содержащий в поверхностном слое винилсодержащие группы и антиген - вирус гриппа.. Этот сорбент получается по упрощенной технологии,, не требует затрат большого количества времени и вредных ядовитых реактивов, химически устойчив, дешев, долговечен и, главное, обладает высокой сорбционной емкостью по антигену - вирусу гриппа, что позволяет повысить выход чистых антител в 2,2 раза при увеличении степени из очистки от белка в 90-120 раз.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА для вьщеления противогриппозных антител путем модификации носителя с последующей сорбцией антигена - вируса гриппа, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью повышения сорбционной емкости по антигену, в качестве носителя используют макропористое стекзпо, которое подвергают модификации обработкой .парами винилтрихлорсилана в токе инертного газа при HO-IBO C и гидpoлизo f полученного продукта парами воды. 2. Способ по п. 1, о т ji и ч а ющ и и с я тем, что обработку парами винилтрихлорсилана ведут в течение 20-30 мин. (Л

Агароза « BfC|i(

37-39 t вирус гриппа прототип

трис+НСН + 1Ми ЗМ ЙаЗ

22-23

Обработка кислым буфером и снятие трис+НСе+ЗМ Nal 50

Винилсодержащее пористое стекло иммобилизов анны вирус гриппа

Винилеодержащее пористое стекло без иммобилизованного вируса гриппа

41,9

51,5