Способ получения иммуносорбента для выделения антител из кроличьей овальбуминовой сыворотки Советский патент 1983 года по МПК A61K47/00 

Р

4:

СО Изобретение относится к области иммунохимии и может быть использова но для вьщеления чистых специфических антител методом аффинной хроматографии. Известны способы получения иммун сорбентов для выделения антител из кроличьей овальбуминовой сыворотки, заключающиеая в модификации органических и неорганических носителей с последующим закреплением антигена овальбумина. Известны способы получения иммун сорбентов для вьщеления антител из кроличьей иммунной сыворотки на осн ве целлюлозы. Наиболее распростра-ненным методом получения таких имму носорбентов является триазиновый ме тод, заключающийся в обработке целлюлозы или ее производных 2-амино-4 ,б-дихлор-симмтриази ном, растворо карбоната натрия и соляной кислоты последующей промывкой водно-ацетоно вой смесью и 0,1 М фосфатным буферо и связыванием белка - антигона за счет реакции с аминогруппой белка 1 Недостатками этого способа являются сложность и длительность получения таких сорбентов, а также то, что иммуносорбенты -на целлюлозной о нове не находят «широкого применения из-за набухания и сжатия под давлением, кроме того, такие сорбенты под вергаются действию микроорганизмов. -Наиболее перспективными являются неорганические нерастворимые носители, так как они не атакуются микроорганизмами, устойчивы к изменению рН, дешевы и долговечны. Известен способ приготовления антиген- стеклянного иммуносорбента для вьщеления антител из кроличьейовальбуминовой сыворотки, заключающийся в химической модификации носи теля - пористого стекла - 10%-ным раствором у -аминопропилтриэтоксилан в метиловом спирте или толуоле, последующем превращении ешкиламиносилан - стекла в ариламинопроизводные с помощью реакции с п-нитробензоилхлоридом, восстановлении нитрогрупп Na2S203 и сорбцией атигена - овальбу мина. Иммуносорбент промывают и хранят при комнатной температуре 2 . Количество белка, связанного с НОСИУ телем, составляет 14-18 мг/г. Количество выделившихся антител увеличивается с повышением концентрации ова бумина на носителе и составляет 53,4-100%. Недостатками этого способа получе ния иммуносорбента являются: низкая о-СНо-СН $1 I + /| Ph,j5jr Q О сорбционная емкость полученных иммуносорбентов по выделяемым антителам вследствие низкой сорбционной емкости по овальбумину, а также нежелательная неспецифическая сорбция. Целью изобретения является повышение сорбционной .емкости иммуносорбент:а по выделяемым антителам за счет повышения сорбционной емкости по антигену. Цель достигается тем, что по способу получения иммуносорбента для выделения антител из кроличьей овальбуминовой сыворотки путем химической модификации кремнеземного носителя с последующей сорбцией овальбумина модификацию носителя осуществляют обработкой его в токе инертного газа сначала парами треххлористого фосфора при 170-180с в течение 1-2 ч, затем стиролом при 2Q.O-210°C в течение 1-2 ч. В результате обработки образуется Иммуносорбент, устойчивый в интервале рН 2,0-8,5 с размером пор л-100 А, Sijg. 240 . Количество углеродных групп в поверхностном слое сорбента 1,5 мг/г. Эти углеродные группы представляют собой фенил-виниленовый фрагмент, непосредственно связанный с атомом кремния. Механизм реакций, протекающих в результате модификации силикагеля парами треххлористого фосфора в токе инертного газа (аргона или азота) и парами стирола в токе газа-носителя (аргон, азот), можно представить еле-, дующими схемами. В результате взаимодействия с PCIg на поверхности силикагеля образуются следующие группы . ) При обработке фосфор (III) содержащего силикагеля парами стирола за счет активационного воздействия электроннодонорной фосфор (III) содержащей поверхности протекает предварительная сорбция мономера стирола, способствующая дальнейшей полимеризации. Конец полимеризации наступает в результате реакции карбониевого иона растущей цепи с отрицательно заряженной кремнекислородной группой, образовавшейся в процессе i-активации фосфорной группировки и полимеризации стирола: , н /- -,щ-е- 1 о-Ph 0При температуре обработки 200 протекают процессы, сопровож дающиеся выделением паров воды и -: $i-c-CH2Расчет количества элементарных фенил виниленовых фрагментов на поверхности синтезированного углеродсодер жащего сорбента показал наличие на поверхности синтезированного сорбен та 4-6 элементарных фенил-виниленовых фрагментов, образующих полифени вгиниленовую структуру углеродного покрытия, связанного Si-C-связями с силикагелями, на которую эффектив но сорбируется антиген , I Ph Ph Применение метода оптической спе роскопии в отраженном диффузионно рассеянном свете показало наличие полос поглощения с максимумами при Я - 430 нм и Я 500-510 нм. Эти полосы соответствуют числам полифен виниленового ряда поверхностных сое динений, образовавшихся в результат реакций полимеризаций, конденсации и дегидрогенизации, протекающих на поверхности носителя. Оценка длины цепи сопряжения этих соединений показала, что .элементарный фрагмент по лифенил-виниленовой. цепи можно оценить .в 2,5 эффективных двойных связи. Эти имеют коричневый цве что характерно для поливинил-фениле нов. Количество химически сорбированного антигена - овальбумина составляет 36,0 мг/г, что позволяет значительно повысить емкость иммуно сорбента , по антителам,. Увеличение или уменьшение темпера туры обработки носителя стиролом до 180 или 250с не приводит к изменению количества углерода в поверхностном слое, однако структура поверхностных групп в обоих случаях различная, при 180°С в поверхностном ело образуется линейный полимер стирола, соединенный с поверхностным атомом кремния 51-б-С-связЬю,а при 250 С - конденсированный сетчатый полимер стирола. Количество химически сорбированного антигена на носите лях,получейных при 180 и 250°С, снижается до 1,9и 27,7 мг/г соответственно. Проведены опы1:ы по проверке специфичности полученных иммуносорбентов. Для этого использовали неспе

фенил-виниленовый фраг10мент газообразного водорода и образова нием полифенил-вилиленовой структуры углеродного покрытия носителя 00-210С Si-C Cli-НгОPh цифйчную к овальбумину бычью иммуносыворотку (BSA) и специфичную к овальбумину.кроличью антиовалыг буминовую и шyнocывopoткy. Биологическую активность, антител определяют по реакции непрямой гемаглютинации (РИГА) с использованием микротитратора системы Такачи. На иммуносорбентах, полученных в результате обработки носителя стиролом при 200-210°С т.е. содержащих в поверхностном слое полифенил-виниленовые структуры, наблюдается только -специфическая сорбция антител из кроличьей иммуносыворотки. Количество .выделенных антител составляет 90%. |Регенерацию сорбента проводят традиционным метрдом путем -диссоциации с помощью НС Е при рН 3. ( Пример 1. Навеску силикагеля 5 ГдМарки ШСК с размером пор fv-100 А .и удельной поверхностью 240 , высушенного при 180°G, помещают в реактор проточного типа и в токе инертного газа-носителя (азот) обрабатывают парами при 170с в течение 1 ч, удаляют потоком газаносителя (азот) избыток PCS- и образовавшийся НС, затем обрабатывают при парами стирола при концентрации его 5 мг на 1 л газа-носителя (азот) в токе инертного газа в течение 1 ч, в реакторе проточного типа. Расход, инертного газа 15 мл/мин. Далее проводят сорбцию овальбумина в . емкостях на 100 мл при 4°С. Концентрация овальбумйна 8 мг/мл. Отношение жидкой к твердой фазе, т.е. объема раствора овальбумина к навеске, 10:1 (50 мл). Время контакта навески с раствором 3 ч. Полученный иммуносорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2 до отсутствия белка в смывах. Емкость сорбента по овальбумину 36.3мг/г. Количество выделяемых антител 90%. Пример 2. То же, что в примере 1, но в качестве инертного газаносителя используется аргон. Расход инертного газа 20 мл/мин. Концентрация овальбумина 10 мг/мл. Емкость сорбента по овальбумину 36.4мг/г. Количество выделяемых антител 89,5%. 5100947 Пример 3. То же, что в примере 1, но навеску силикагеля обрабатывают парами РСЕд при в течение 2 ч. Емкость сорбента по овальбумину 36,3 мг/г. Количество выделяемых антител 88,0%.5 Пример 4. То же, что в примере 1, но стиролом обрабатывают при 210°С. Емкость сорбента по овальбумину 36,2 мг/г. Количество вьзделяемых д антител 89%. Пример 5. То же, что в примере 1, но стиролом обрабатывают в течение 2 ч. Емкость сорбента по овальбумину 36,15 мг/г. Количество 15 выделяемых антител 88%. Пример ,6. То же, что в примере 1, но стиролом обрабатывают в течение 2 ч при 200°С. Емкость сор3бента по овальбумину 36,1 мг/г. Количество выделяемых антител 88%. Таким образом, предлагаемый способ позволяет приготовить иммуносорбент на основе неорганического носителя - силикагеля, содержаиций в поверхностном слое полифенил -.. виниленовые структуры и антиген овальбумин в количестве 36,0 мг/г, что почти в 2,5 раза больше, чем в прототипе. Этот сорбент не требует затрат большого количества времени. является специфичным и биоселективным к антителам кроличьей овальбуминовой сыворотки, химически устойчив, долговечен и дешев. Количество выделяемых антител примерно в 2 раза выше, чем в прототипе, и сорбент обладает всеми достоинствами, присущими неорганическим сорбентам.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА для ВЫДЕЛЕНИЯАНТИТЕЛ из КРОЛИЧЬЕЙ ОВАЛЬБУМИНОВОЙ СЫВОРОТКИ, путем химической модификации кремнеземного носителя с последующей сорбцией овальбумина, о т л и ч а ю -г щ и и с я тем, что, с целью повыиения сорбционной емкости И1«в«уносорбента по выделяемым антителам путем по- вьшения сорбционной емкости по антигену,модицикацию носителя осуществляют обработкой его в токе инертного газа сначала парами треххлористого фосфора при 170-180С в течение 1-2 ч затем - стиролом при 200-210 0 в , течение 1-2 ч. (Л