Способ определения вирусных антигенов Советский патент 1988 года по МПК G01N33/49 

00

со о:

Изобретение относится к вирусологии. Цель изобретения - повьппение точности способа. Получают антигло- булиновую сьшоротку против вирусов гриппа и смешивают с сьгаороткой больного. Смесь вьщерживают при 37°С 1 ч и центрифугируют. Надосадочную жидкость раститровьюают в вирусологическом планшете и определяют титр вируса грийпа или его антигенов путем постановки реакции агглютинации куриных эритроцитов. Чувствительность способа повышается в 12 раз.

ел

со

10

Изобретение относится к медици- н(е, а именно к вирусологии, и может быть использовано для выявления циркуляции иммунных комплексов в биологических жидкостях при вируснь:х инфекционных болезнях, }1дя диагностики и определения активности инфекционного процесса при вирусном гепатите.

Целью изобретения является повыше- Цче точности способа за счет увели- х|ения чувствительности и специфич- 1|ости и сокращение сроков анализа. : Цель достигается тем, что сьгоорот-15 Йу крови или другой биосубстрат инфек-т Ционного больного инкубируют со специфической антиглобулино}зой сьторот- кой против искомого вируса или вирус- Йогр антигена и с помо0(ыо известных 20 иммунологических реакций - гемагглю- Тинации, пассивной гемагглютинации, торможения гемагглютинации, преципита- 1)(ии в геле, встречного ш тмуноэлектросоставлять 1:5. Смесь в течение 1 ч перемешивают и выдерживают в холоди нике при 4°С в течение 12-16 ч. Выпавший осадок удаляют, а к надосадо ной жидкости добавляют активированный уголь (3-4 гр) до полного обесцвечивания пены. Смесь перемешивают 30 мин и фильтруют. К полученному фильтрату сыворотки при постоянном ремешивании прибавляют со скоростью 10 капель в минуту насыщенный раствор (NH4)-2S04. до 45% насьш1ения, пер мешивают в течение 1 ч и охлаждают при 4 с в течение 16 ч. Вьшавший ос док отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надос дочную жидкость удаляют, осадок рас воряют в дистиллированной воде, рас вор диализзпот через целлулоидную пле ку с диаметром пор 320-720 ммк против 0,15 М раствора NaCl. В процесс диализа объем высаленных глобулинов .доводят до 1/1 О ч. по отношению к

35

фореза (ВИЭФ), иммуноферментного или 25 объему исходной сьгаоротки, т.е. до Других методов определяют вирус или вирусный антиген.

Способ осуществляют следующим об- 1|)азом.

Пример 1. Для осуществления 30 Способа вначале получали иммунную ан-г фиглобулиновую сыворотку к антителам, Направленным против искомого вируса - фируса гриппа или его антигенов. | Для этого берут 100 мл сьшоротки йрови переболевших: гриппом больных,, Ьодержащую высокие титры противогриппозных антител (1:320). Затем из сыворотки методом сульфат-риванолового высаливания вьщеляют глобулиновую фракцию. К сьшоротке добавляют 0,01 р-р NaOH, доводят рН до 7,4. Эту сыворотку по ,каплям со скоростью 4-8 капель в минуту вносят Е 500 мл 0,3%-ный раствор риванола при постоянном помешивании. Соотношение объемов сьшоротки и риванола в мл должно

40

45

1 О мл.

Полученный препарат - иммуноглоб лин против вируса гриппа - характер зуют по следующим параметрам:

Специфическую антиглобулиновую : сыворотку против иммуных противогри позных глобулинов получают путем им мунизации кроликов высоленным препа ратом по следующей схеме:

Срок введе- Количество вводимого НШ1 (в днях) препарата

0,5 мл полного адъю- ванта Фрейнда + -I- 0,5 мл сьшоротки О,1 мл глобулинов О,1 мл глобулинов 0,1 мл глобулинов 0,1 мл глобулинов о,1 мл глобулинов

0

5 0

составлять 1:5. Смесь в течение 1 ч перемешивают и выдерживают в холодильнике при 4°С в течение 12-16 ч. Выпавший осадок удаляют, а к надосадоч- ной жидкости добавляют активированный уголь (3-4 гр) до полного обесцвечивания пены. Смесь перемешивают 30 мин и фильтруют. К полученному фильтрату сыворотки при постоянном перемешивании прибавляют со скоростью 10 капель в минуту насыщенный раствор (NH4)-2S04. до 45% насьш1ения, перемешивают в течение 1 ч и охлаждают при 4 с в течение 16 ч. Вьшавший осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надоса- дочную жидкость удаляют, осадок растворяют в дистиллированной воде, раствор диализзпот через целлулоидную пленку с диаметром пор 320-720 ммк против 0,15 М раствора NaCl. В процессе диализа объем высаленных глобулинов .доводят до 1/1 О ч. по отношению к

объему исходной сьгаоротки, т.е. до

1 О мл.

Полученный препарат - иммуноглобулин против вируса гриппа - характеризуют по следующим параметрам:

Специфическую антиглобулиновую : сыворотку против иммуных противогриппозных глобулинов получают путем иммунизации кроликов высоленным препаратом по следующей схеме:

Путь введения

в/к

в/м в/в в/в в/м в/в

1396059

0,-1 мл глобулинов 0,1 мл глобулинов 0,1 мл глобулинов о,1 мл глобулинов

При ме ч а н не: в/к - внутрикожно; в/м внутримьшечно; в/в - внутривенно.

15

20

Через 7 дней после последнего сро- ка введения препарата проводят забор крови, из которой получают сыворотку,/ О Полученная антисьгеоротка содержит антитела против человеческих иммуноглобулинов к вирусам гриппа, т.е. антитела против спедшфических противогриппозных антител. Титр полученной сыворотки 1 :128.

Для определения вирусных антигенов берут две пробирки с 0,25(0,05)мл исследуемого биосубстрата (сыворотка больного) ив 1 из пробирок вносят 0,25 ) мл полученной кроличьей антиглобулиновой сьшоротки в рабочем титре 1:16. В другую пробирку вносят 0,25 (0,05) мл 0,15 М раствора NaCl, забуференного 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,1 (контроль). Пробирки вьщерживают 60 мин при 37°С, затем центрифугируют 20 мин при 3000 об/мин Надосадочную жидкость отбирают пипеткой и раститровывают в вирусолргичес ком планшете, ячейки которого заполнены 0,15 М раствором NaCl, забуференного 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0-7,1. В этом планшете определяют титр вируса гриппа или его антигенов путем постановки реакции агглютинации куриных эритроцитов. Так, в контрольном материале титр вирусных антигенов составляет 1:2, а в опытном

предлагаемого способа в 10,25 раз выше известного.

П р и М е р 3. Определение специфичности способа.

Б сыворотках 156 больных с диагнозом аденовирусная инфекция, пара- грипп, микоплазменная инфекция, орви определяли содержание антигенов вируса гриппа известным способом. И в сыворотках I68 больных с теми же диагнозами - предлагаемым способом. Спе- цифичность определяли соотношением количества отрицательных результатов в контрольной группе к количеству обследуемых лиц в этой группе, умножен , ное на J00%. Известный способ обеспечил 21 отрицательную находку вирусного антигена, что составляет 13,5% специфичности, в то время как предлагаемый - 163, что составило 91% специфичности. Таким образом, специфичность предлагаемого способа при 30 определении антигенов вируса гриппа в 6,7 раза вьппе известного.

П р и М е р 4. Сьгооротку крови ре- конвалесцента М. исследовали на наличие вируса гриппа, находящегося в иммунном комплексе вирус гриппа + антитело. Известным способом вирус грип па из сьдаоротки крови не выявлялся. Его удалось выделить лишь после обработки зтой сыворотки антиглобули25

35

образце, обработанном антиглобулино- ° сывороткой, полученной как опи- вой сывороткой, 1:8-1:16. Таким об- примере I. Для этого сыворот- разом, предлагаемый способ повышает, как минимум, в 4 раза способ определения вирусов гриппа или его антигеку крови инкубировали с антиглобулиновой сывороткой при 37°С в течение 60 мин, после чего этим матери алом за

45 ражали 9-10-дневных куриных эмбрионов введением материала в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость. Зараженные эмбрионы инкубировали в течение 72 ч при 33°С, после чего их охлаждали,

нов.

Пр и М ер 2. Определение чувствительности способа.

Сыворотки 510 больных гриппом исследовали на наличие антигенов вируса гриппа известным способом и сьшоротки 712 больных - предлагаемым способом. CpcjKH определения вирусных антигенов и возраст больных обеих групп обследуемых были идентичными. Известный способ позволяет выявить антиген лишь в четырех случаях, в то время как предлагаемый - в 41 случае. Таким образом, чувствительность

в/в в/м в/в в/в

15

20

/ О предлагаемого способа в 10,25 раз выше известного.

П р и М е р 3. Определение специфичности способа.

Б сыворотках 156 больных с диагнозом аденовирусная инфекция, пара- грипп, микоплазменная инфекция, орви определяли содержание антигенов вируса гриппа известным способом. И в сыворотках I68 больных с теми же диагнозами - предлагаемым способом. Спе- цифичность определяли соотношением количества отрицательных результатов в контрольной группе к количеству обследуемых лиц в этой группе, умножен- , ное на J00%. Известный способ обеспечил 21 отрицательную находку вирусного антигена, что составляет 13,5% специфичности, в то время как предлагаемый - 163, что составило 91% специфичности. Таким образом, специфичность предлагаемого способа при 30 определении антигенов вируса гриппа в 6,7 раза вьппе известного.

П р и М е р 4. Сьгооротку крови ре- конвалесцента М. исследовали на наличие вируса гриппа, находящегося в иммунном комплексе вирус гриппа + антитело. Известным способом вирус гриппа из сьдаоротки крови не выявлялся. Его удалось выделить лишь после обработки зтой сыворотки антиглобули25

35

сывороткой, полученной как опи- примере I. Для этого сыворот-

ку крови инкубировали с антиглобулиновой сывороткой при 37°С в течение 60 мин, после чего этим матери алом заражали 9-10-дневных куриных эмбрионов введением материала в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость. Зараженные эмбрионы инкубировали в течение 72 ч при 33°С, после чего их охлаждали,

аллантоисную жидкость отделяли и исследовали на наличие вируса гриппа в реакции агглютинации куриных эритроцитов. Титр вируса в аллантоисноК жидкости составляет 1:16. Таким образом показано, что в исследуемой сыворотке больного находился вирус гриппа в форме иммунного комплекса.

Исследованы биосубстраты 356 боль- щ,1х. гриппом. Вирус гриппа, находящийся в форме иммунного комплекса, обнаружен в 5,8% случаев.

П р и м е р 5, Способ определения антигенов вируса гепатита В.

При- осуществлении способа получают иммунную антиглобулиновyio сыворотку против антител, направленных против HBjAg, Для этого из сыворотки крови больных, переболевших вирусным гепати том В с высоким титром антител против вируса гепатита В (:128), методом сульфат-риванолового высаливания выделяют гамма-глобуликовую фракцию, :как в примере 1. Полученным гамма-гло булином иммунизируют кролика по схе- :ме, описанной в;примере I. Через 7 дней после последнего введения препарата, проводят забор крови, из которой ;получают сьгооротку. Полученная кропичья сьшоротка содержит антитела про- тив человеческих иммуноглобулинов к iантигенам вируса гепатита В, т.е. ан- титела против специфических антител к HBgAg. Титр полученной сыворотки 1:128.

G помощью полученной сыворотки по :предлагаемому способу определяли антиген вируса гепатита В;, т.е. . :Для этого анализировали сьшоротку |крови контактного по гепатиту В у которого клинические симптомы болез- ни не-были зарегистрированы. Уровень |антител к -HBgAg в этой сьгооротке составлял 1:2, После использования пред

шагаемого метода с добавлением к ис следуемому материалу антиглобулиновой сьгооротки титр HBjAg составил i256.

П р и м е р 6. Определение чувствительности способа определения антигена вируса гепатита В,

Сьшоротку, полученную от 196 больных вирусным гепатитом, исследовали на наличие HBjAg известным способом, а от 211 больных предлагаемым способом. Известный способ позволил выявить в 15 случае HB|)Ag, что составило 79,2%, в то время как предлагаемый - 160 положительных реакций или 84,6%.

Таким образом, чувствительность предлагаемого способа, в 1,2 раза пре вьшает известный способ.

П р и м е р 7. Опре/;еление специфичности способа определения антигена вируса гепатита В. ,

В сьшоротках 121 больного с диагнозом гепатит А колиэнтериты определяли содержание HBgAg извест

д

;

0

5

0

5

ным и предлагаемым способом. Оценку специфичности способа давали по методу, описанному в примере 3. Известный способ обеспечил 57 отрицательных находок, что составляет 47,1% специфичности, в то время как предлагаемьш - 119, что составило 91% специфичности. Таким образом, специфичность предлагаемого способа при определении HBgAg в 2 раза выше известного.

Примере. Сыворотку крови ре- конвалесцента Г. исследовали на наличие , находящегося в форме иммунного комплекса + антитело. Известным методом исследования выявить. HBgAg находящийся в форме иммунного комплекса не удалось. Он определен лищь после обработки этой сыворотки антиглобулиновой сьгоороткой. Для этого сьшоротку крови инкубировали с антиглобулиновой сывороткой при 37°С в течение 60 мин, центрифугирова- ли при 3000 об/мин в течение 20 мин и определяли . Титр составил 1:16, Таким образом показано, что в исследуемой сыворотке находился HBjAg в форме иммунного комплекса.

Предлагаемым способом исследованы сыворотки крови 211 человек: 83 боль- .ных острым гепатитом В, 9 - затяжным, 27 - хроническим активным, 14 - хроническим персистирующим, 59 здоровых доноров носителей HBgAg. Предлагаемый способ позволяет выявить HBgAg на 3,4- 33% случаев чаще, чем известный, а у бессимптонных носителей - на 78,5%,

Таким образом, предлагаемый способ повышает точность определения вирусных антигенов за счет увеличения чувствительности и специфичности анализа при определении антигенов вируса гриппа и гепатита В, а также дает возможность определить вирусы или их антигены, входящие в состав иммунных комплексов, в течение 4ч, в то вре- мя как по известному способу на эти исследования необходимо 48 ч.

Формула изобретения Способ определения вирусных антигенов путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет увеличения чувствительности и специфичности и сокращения продолжительности анализа, исследуемую сьторотку для образования иммунных комплексов обрабатьшают равным объе713960598

MOM антисьгеоротки, полученной иммуни- нием комплексов центрифугированием и задней кроликов антителами человека определением содержания антигена в против вируса, с последующим отделе- надосадочной жидкости.