Способ получения сорбента Советский патент 1984 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к медицинской промБпяленности и касается производства сорбентов для очистки вирусов гриппа методом гель-хромато рафии . Наиболее распространенным методо для вьщеления и очистки вирусов гриппа из вирусосодержащей жидкости является метод эксклюзионной (гельхроматографии) хроматографии с применением сорбентов на основе пористого стекла. При этом сорбент должен обладать минимальной сорбционной емкостью по отношению к виру, сам гриппа и сопутствующим белкам Метод основан на разделении вирусов и белков по принципу молекулярных сил. Отсутствие активных центров на поверхности сорбента исключает воз|иожность сорбции белков или вирусов что, в свою очередь, позволяет наиболее полно выделить вирусы гриппа и отделить их от белка. Сорбент, иcпoльзye шй для гель-хроматогра фии, должен обладать стабильностью исключающей попадание модификатора в целевой продукт, механическими свойствами, позволяющими фильтровать и наполнять колонку, быть нечувствительньам 1к микробному воздействию и к изменениям рН. Известен способ получения сорбен та для выделения и очистки вирусов гриппа путем модифицирования макропористых стекол компонентами аллантоисной жидкости Ц . Недостатком этого способа являет ся нестабильность получаемого сорбента вследствие того, что процесс модифицирования является нестабильным, зависящим от принципиальной нестабильности различных параметров вирусосодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ). Кроме того,модифицированные стек ла можно стерилизовать только химически (формалином), а выход вируса достигается в жестких условиях по рН и концентрации НаСЕ. Известен также способ получения сорбента путем модификации носителя титаносодержащими группами 2j . Недостатком этого способа являет ся то/ что лолучаемый сорбент обладает большой сорбционной емкостью к белку и использование водных растворов для модификации (пропитка) не позводяет получить необходимое число и расположение слоев, т.е требуемую структуру сорбента, В результате этого не обеспечивается во производимости результатов при выделении вируса гриппа. Наиболее близким к изобретению п технической сущности является спосо получения -сорбента для выделения и очистки вируса гриппа nyTeNs модификации пористого стекла поливинил пирролидоном (ПВП). Процесс обычно проводят в водном растворе в статических условиях, после адсорбции пористое стекло с модификатором отмывают дистиллированной водой и подвергают термообработке. Использование полученного сорбента позволяет выделять вирус гриппа в зависимости от используемого штамма на 16-48% (выход вируса) при удельной активности 0,36-1,41 (отношение титра вируса к содержанию белка в пике). Этот сорбент в настоящее время широко используется в медицинской промышленности з . Недостатками известного способа являются непрочная модификация стекла, что приводит к сползанию модификатора с поверхности носителя и попаданию в целевой продукт, необходимость повторного модифицирования сорбента поливинилпирролидоном через 7-10 хроматографических циклов (через 3 мес.), что является нетехнологич ъял, а также низкий выход вирусов гриппа при низкой степени его очист ки, высокая стоимость ПВП и длительность процесса модификации носителя. Целью изобретения является повышение стабильности сорбента и обеспечение возможности повышения выхода и удельной активности вируса при выделении. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу-получения сорбента для вьаделения и очистки вирусов гриппа путем модификации пористого стекла, модификацию осуществляют трех-четырех кратной обработкой пористого стекла парами Tici при 160-180 0 в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина. Кроме того используют раствор овальбумина при общем содержании последнего ISOtlO мг в расчете на 1 г сорбента. Технология получения сорбента для очистки вирусов гриппа состоит в попеременной обработке носителя пористого стекла с размером пор ,. 2000 А, удельной поверхностью 25м /г парами четыреххлористого титана и воды при -t 16О-ISO С три-четыре раза и обработке, титансодержащего;; сорбента раствором овальбумина. Такая обработка приводит к созданию на поверхности пористого стекла титансодержащих групп, связанных с поверхностью прочными ковалентными связями заданного состава и строения. В результате полученный сорбент не требует повторного модифицирования (количество титана на сорбенте после 200 хррматографнческих циклов оставалось практически равным исход ному содержанию - 0,24 мг-экв/г для трехкратной обработки и 0,30 мг экв/г для четырехкратной: обработки). Пр этом модификация титан-оксидными группами приводит к снижению раство римости стекла и выходу кремния в раствор с 0,05 мг/мл без модификаций до 0,005 мг/мл после. Обработку овальбумином проводят путем сорб- ции из раствора в емкостях на 100 м при tt:4 C, Полученный сорбент отмы вают .от белка фоновым буфером. Обра ботка овальбумином сорбентов с трем и четырьмя слоями гидроксидных групп приводит к практически полном взаимодействию активных центров поверхности сорбентов с белком (85-95%). OTNMBKa белка фосфатным фоновым буфером рН 7,2 с 0,15М NaCl, а также десорбция белка буфер ными растворами рН 2,,0 с ионной силой с 0,15 - 1,5 М NaCl не приводит к снятию белка, т.е. овальбумин связан с поверхностью прочными химическими связями, при этом увеличение или снижение количества циклов модифицирования (один, два, пять, шесть) при обработке овальбумином снижает количество химически сорбированного белка до 50%, что, в свою очередь, освобождает активные центры поверхности. Выбранный интервал температур 160-180 С обработки носителя парами четыреххлористого титана обусловлен тем, что при этой температуре повер .ность стекла наиболее гидроксилирована. Увеличение температуры приводит к дегидратации ОН-групп на поверхности, а следовательно, к снижению количества, вступивших в реакцию с Т Сб гидроксилов, т.е. уменьшению модификатора в поверхностном слое и снижению активности. Уменьшение температуры обработки приводит к замедлению взаимодействия T.J а с гидроксильными группами а также не исключает возможности присутствия молекулярно-связанной воды, которая при взаимодействии с ТДСЦ может привести к частичному, нековалентному связыванию модификатора с поверхностью носителя, т.е. снижению устойчивости сорбента. Выбранное время обработки носителя парами Т|Свц100-120 мин обусловлено тем, что 100 мин это то время, йри котором все гидроксильные группы поверхности вступают во взаимодействие с парами TiCl . Увеличение времени обработки выше 120 мин не целесообразно, так как поступающие пары, не реагируя, выводятся из реактора. Уменьшение времени контакта снижает количество модификатора в поверхностном слое, что, в свою очередь, снижает количество активных центров, вступающих в реакцию с оваль бумином. Таким образом, необходимость трехчетырехкратного модифицирования обусловлена тем, что увеличение или снижение количества циклов модифицирования при обработке овальбумином снижает количество химически сорбированного белка до 50%. При этом освобождаются активные центры поверхности, вступающие во взаимодействие с белком или вирусом при гель-хроматографии, что является н едопус т имым. Пример. Навеску пористого стекла в количестве 1 г с размером пор 2000 А, очищенного от примесей и высушенного при температуре около 180°С, обрабатывают парами четыреххлористого титана в течение 100 мин при в реакторе проточного типа в токе воздуха. Затем удаляют пары TiCl и образовавшегося хлористого водорода и проводят гидролиз парами воды. Такую обработку проводят три раза. ; Количество титан-оксидных групп 0,24 мг.экв/г. Далее проводят сорбцию овальбумина в емкостях на 10.0 мл при 4°С с концентрацией овальбумина 2 мг/мл. Полученный сорбент промывают фосфатным буфером рН 7,2. Емкость сорбента по овальбумину 100 мг/мл. Химическая сорбция белка овальбумина 85%. П р и Т, с 2. Аналогично примеру 1, но обработку парами четыреххлористого титана проводят 120 мин. Количество титан-оксидных групп 0,25 мг экв/г. Емкость сорбента по овальбумину 108 мг/мл. Химическая сорбция овальбумина 87,4%. Пример 3. Аналогично примеру 1, но обработку парами TiCS проводят при t 180°С. Количество титан-оксидных групп 0,23 мг экв/г. Емкость сорбента по овальбумину 105 мг- экв/г. Химическая сорбция овальбумина 86%. Пример 4. Аналогично примеру 1, но модификацию проводят четыре раза. Количество титан-оксидных групп 0,30 мг.экв/г. Емкость сорбента по овальбумину 120 мг/г. Химическая сорбция овальбумина 95%. Пример 5. Навеску пористого стекла с размером пор 2000 А в 1 г, очищенного от примесей и высушенного при t 180° , обрабатывают парами Т С14. в течение 100 мий при t 180° в реакторе приточного типа в токе воздуха. Затем удаляют пары TiCl и образовавшегося, хлористого водорода и проводят гидроЛИЗ парами воды. Такую обработку проводят четыре раза. Количество титан-оксидных групп 0,31 мгэкв/г Емкость сорбента по овальбумину 118 мг/1. Химическая сорбция оваль йумина 93,6%. Гель-хроматографию проводят на колонке с диаметром 0,44 см, пло щaдью поперечного сечения 0,16 см высотой слоя сбрбента 14-15 см, объем сорбента 2,2-2,4 мл при скорости элюции 100 мл/ч-см. В качес ве элюирующего буфера используют фоновый буфер, т.е. 0,1 М фосфа ный буфер рН 7,2на 0,15 М N зС1. На колонку наносят вирусосодержащую aллaнtoиcнyю жидкость в объеме 0,1 мл (4-5 % от объема колонки). Запись хроматограммы проводят на приборе РЭППС-1М. Эффективность выделения и очист ки вируса оценивают по выходу виру са и величине удельной активности (отношение титра вируса к содержанию белка в пике). В работе используют штаммы виру сов гриппа Х-Ленинград-54/Н , N Стабл.1), А (УФА(, ) (табл.2;, А-385 (. 5 ) (табл.З). Опыты по очистке вирусов гриппа проводят на сорбентах на основе пористого стек ла и модификаторов окиси титана (при различном количестве циклов модифицирования) и овальбумина. Для сравнения испытаны сорбенты на основе пористого стекла и. модификатора поливинилпирролидона. Результаты представлены в табл. 1-3. Из приведенных данных видно, чт модификация пористого стекла титаноксиднЕгЛ и группами и свальбумином независимо от применяемых штаммов вируса приводит к значительному увеличению выхода вируса по сравнению с известным. При этом резко сокращается количество белка в вирусном пике, т.е. повышается степень очистки вируса (удельная активность) . Оптимальными свойствами обладают сорбенты, полученные в результате трех-четырехкратного модифицирования .пористого стекла титаноксидными группами и Ьвальбуми- ном. Таким образом, способ получения сорбента для выделения и очистки вирусов 1риппа, заключающийся в модификации пористого стекла парами TiCl при 160-180с в течение 100-120 мин с последующим гидролизом продукта парами воды, причем процесс : модифицирования повторяют три-четыре раза, и обработке овальбумином, позволяет создать сорбент, который на стадии гель-хроматографии повьниает эффективность выделения вирусов гриппа независимо от используемого штамма вируса примерно в два раза при увеличении удель- ной активности в четыре-девять раз. Сорбент, полученный по предлагаемому способу, устойчив, не требует повторного модифицирования. Тем самым, увеличивая срок .службы сорбента и снижая затраты на его получение, исключается переход модификатора с поверхности, а также ионов кремния в целевой продукт, что упрощает технологию получения вакцин. Таблица 1

1.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА для выделения и очистки вирусов гриппа путем модификации поргистого стекла, отличающийся тем что, с целью повышения стабильности сорбента и обеспечения возможности повышения выхода и удельной активности вируса, модификацию осуществляют трех-четырехкратной обработкой пористого стекла парс1ми Т;Сб при 160-180°С в течение 100-120 мин и гидролизом продукта парами воды после каждой стадии с последующей обработкой полученного продукта раствором овальбумина. 2. Способ по п.1, отличаю- щ и и с я тем, что используют § раствор овальбумина при общем содержании последнего 150+10мг в расчете на 1 г сорбента.

Пористое стекло,модифицированное поливинилпирролидоном (известного)

Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное -в результате, одного цикла обработки) и овальбумином.

1:328 16,0 343 0,96

1:328 16,0 261 1,26

0,09

Пористое стекло, модифицированное двумя слоями титана (полученное в результате двух циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана (полученное в результате трех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями титана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана (полученное в результате пяти циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло,модифицированное шестью слоями титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овальбумином. .Примечание.

Пористое стекло, модифицированное поливинилпирролидоном (прототип)

Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное в результате одного цикла обработки) и овальбумином.

0,18

1:328

16,0 313 1,48

0,24

1:656

32,0 170 3,86

0,30

1;656 32,0 183

3,58

1:328 16,0 337

0,46

0,97

0,60

1:328 16,0 338

0,97

1:100 39,0 280 0,36

1:122 48,0 150 0,81

0,09 Исходный титр 1:2048. В табл. 1-3 титр вируса является) среднеарифметической величиной, рассчитанной из нескольких опытов. Таблица 2

Пористое стекло, модифицированное Д9УМЯ слоями титана . (полученное- в результате двух циклов обработки) и овгшьбумином.

Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана (полученное в результате трех циклов обработки) и овальбумином

Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями титана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана (полученное в результате пяти циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное шестью слоями титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овальбумином.

Примечание. Исходный титр It 256.

Пористое стекло, модифицированное поливинилпирролидоном (известный)

Пористое стекло, модифицированное одним слоем титана (полученное в результате одного циклэ обработки) и овальбумином .

Продолжение табл. 2

.0,18

1:144 56,0 194 0,74

0,24

1:200 -78,0 92 2,17

0,30 1:212 83,0 76 2,80

0,46

1:130 51,0 180 0,70

1:.146 57,0 162 0,90

0,60

. v

Таблица 3

1:492 48,0 350 1,41

1:584 57,0 135 4,33

0,09

Пористое стекло, модифицированное двумя слоями титана (полученное в результате двух циклов обработки) и ов аль бумином

Пористое стекло, модифицированное тремя слоями титана (полученное в результате трех циклов обработки) и ов аль бумином.

Пористое стекло, модифицированное четырьмя слоями титана (полученное в результате четырех циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное пятью слоями титана (полученное в результате пяти циклов обработки) и овальбумином.

Пористое стекло, модифицированное шестью слоями титана (полученное в результате шести циклов обработки) и овёшьбумином.

Примеч.а ни е. Исходный титр 1:1024.

Продолжение табл. 3

1:512 50,0 208 2,46

0,18

1:768 75,0 87,5 8,78

0,24.

1:748 73,0 60,0 12,47

0,30

1:512 50,0 184 2,78

0,46

1:584 57,0 1503,89

0,60