Способ получения стимулятора из селезенки млекопитающих Советский патент 1985 года по МПК A61K35/28 

1 1 Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано для иммуностимуляции организма. Цель изобретения - повышение им муностимулирующей активности. Цель достигается тем, что согласно способу получения стимулятора из селезенки млекопитающих, включаюи1ему обработку органа ацетоном, его измельчение, получение надосадочной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, измельченную селезенку экстрагируют в 3%ном растворе уксусной кислоты при рН 3,0-4,0 с добавлением хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстра гируют водой в присутствии уксусной кислоты при рН 6,0-7,0 с последующим фильтрованием и лиофилизацией, Переработка путем экстрагирования измельченной селезенки в 3%-ном растворе уксусной кислоты позволяет произвести гидролиз крупных белков . и других высокомолекулярных соединений, что способствует лучшей очист ке и устранению пирогенности. Добавление хлористого цинка способствует полному выделенш) из селезенки конечного продукта и лучшему осалодению его ацетоном. Экстракция осадка в воде при определенном рН (экстрагент - раствор уксусной кислоты) способствует растворению в воде наиболее активных веществ и позволяет отделить от них нерастворимые балластные вещества путем фильтрации, Отклонение от заданных пределов .кислотности приводит к потере активного вещества. Существующие известные решения не имеют свойств, присущих предложенному. Концентрация спиртовой фракции, концентрация диализата, приводит к разрушению специфического начала вещества в результате гидролиза. Предложенное в известных способах отделение балластных веществ происходит за длительный период и малоэффективно. Отделение сопутствую щих веществ ведет к потерям. Способпрототип | взятый эа базовый объект, позволяет получить вещество, которое ингибирует синтез ДНК, но не оказьгеает стимулирующего действия . 2 на лимфоциты и активные Т-лимфоциты селезенки. Пример I. Берут селезенку крушюго рогатого скота, промывают водой. Селезенку помещают в ацетон, берут 1 часть селезенки и 10 частей ацетона с температурой -зс. Через 24 ч ацетон сливают, а селезенку 0,5 кг измельчают и помещают в реактор с мешалкой. Измельченную селезенку заливают 5 л раствора 3%-ной уксусной кислоты при рН 3,О, добавляют 0,005 у.г хлористого цинка и экстрагируют 36 ч, перемешивая 1 ч через каждые 8 ч. По окончании экстракции субстрата сливают и центрифугируют 15 мин со скоростью 3000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют, к ней добавляют 6 час- тай ацетона на 1 часть жидкости, перемешивают и формуют осадок 20 ч. Выпавший осадок высушивают на фильтре, измельчают и растворяют 0,01 кг в 0,5 л воды с добавлением уксусной кислоты до ,0, В течение 2 ч непрерьшно перемешивают и удаляют балластные вещества путем фильтрации, Полученньй раствор стерильно фильтруют через пластины ЕК, разливают во флаконы так, чтобы в каждом содержалось 10 мг вещества и лиофилизируют. Выход активного вещества 0,005 кг, Пример 2, Берут селезенку животных, промывают водой и ацетоном, помещают 1 часть селезенки в 10 частей ацетона с температурой -5 С, Через 24 ч ацетон сливают. 10 кг селезенки измельчают на волчке, помещают в реактор и заливают 100 л раствора уксусной кислоты до рН 4,0, добавляют 0,1 кг хлористого цинка и экстрагируют 36 ч, перемешивая непрерьгоно по часу через каждые 8 ч. По окончании экстракции субстрат сливают и центрифугируют 15 мин со скоростью 3000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют, к ней добавляют 6 частей ацетона на 1 часть жидкости, перемешивают и формируют осадок 20 ч. Выпавший осадок высушивают на фильтре, измельчают и растворяют 0,2 кг осадка в 10 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН 6,0, Б течение 2 ч перемешивают и удаляют балластные вещества фильтрацией. Отфильтрованный раствор стерильно фильтруют через пластины ЕК& разливают во флаконы так, чтобы в каждом содержалось 10 мг веществаи лиофилизируют, Получают 0,1 кг активного вещества из 10 кг сырья. Пример 3, Берут свиную селезенку, промьгоают, помещают в ацетон г. температурой -5°С, выдерживают сутки,сливают ацетон. Берут 1 кг селезенки, измельчают и экстрагируют в 10 л 3%-ного раствора уксусной кис лоты при рН 3,5. Добавляют 0,01 кг хлористого цинка, экстрагируют 36 ч попеременно перемепшвая. По окончании экстракции субстрат сливают. центрифугируют, надосадочную жидкос декантируют,к ней добавляют 6 часте ацетона на 1 часть жидкости,перемеш вают и формируют осадок за 20 ч.Пол .ченный осадок высущивают и измельча ют. Осадок в количестве 0,02 кг рас воряют в 1 л воды с добавлением уксусной кислоты до рН 6,5, перемещи вают и удаляют балластные вещества фильтрацией. Раствор стерильно фильт руют и разливают во флаконы по 10 мг вещества, лиофилизируют. Выход активного вещества из исходного сырья составляет 0,01 кг. Биологическую активность вещества вьщеленного из селезенки, оценивали по показателям иммунитета эксперимен тальных животных. Эксперименты проводили на 50-ти морских свинках, самцах весом 200250 г. Животные бьти разделены на 5 равных групп: контрольную и подопытные. Подопытным животным вводили по 0,1 мг (рекомендуемая для людей терапевтическая доза) активных веществ, выделенных из селезенки различными способами, растворенных в 0,5 мл физиологического раствора. Вещества вводили ежедневно внутримьшечно в течейие 20 дней. Контрольным животным по аналогичной схеме вводили по 0,5 мл физиологического раствора. На 21-е сутки всех, животных забивали, вьщеляли селезенку и лимфатические узлы. Ткань селезенки и лимфатических узлов гомогенизировали, выделяли клетки и затем определяли удельную концентрацию лимфоцитов (удельная концентрация - количество клеток в тысячах на Г мг ткани) и активных Т-лимфоцитов ме

тодом спонтанного розеткообразованйя с эритроцитами кролика. Известно, что лимфоциты и активные Т-лимфо1 1

Проведены эксперименты, подтверждающие высокую эффективность препарата в отношении стимуляции антител 1 4 циты являются «тммунокомпетеитными клетками. Установлено, что введение вещества, полученного из селезенки по предложенному способу приводит к значительному увеличению лимфоцитов и активных Т-лимфоцитов в селезенке. Все остальные вещества, полученные известньми способами подобной активностью не обладали. При физико-химическом анализе выделенного из селезенки вещества установлено, что оно представляет собой комплекс полипептидов. Изучение токсичности и аллергизирующих свойств выделенного вещества на лсивотных показало, что препарат из селезенки не обладает в терапевтических дозах подобной активностью. Это указьшает на перспективность препарата из селезенки для применения в медицинской практике. Эксперименты, проведенные на животных, указьшают на тканеспецифическую стимуляцию иммунокомпетентных клеток в селезенке под воздействием вещества, вьщеленного из этого же органа. Это явление может быть использовано для создания лекарственного препарата с целью стимуляции активности клеток селезенки, где, как известно, происходит образование и функционирование антителообразующйх клеток после появления антигенов в организме. Известно, что применение различных цитостатических средств, ионизирующей радиации, глюкокортикоидов приводит к резкому подавлению иммуногенеза. Поэтому применение в этих случаях препарата из селезенки является целесообразным и полезным. Для получения вещества предложенным способом имеется в достаточном количестве сырье. Известно, что в селезенке присутствуют лимфоциты (антителообразующие клетки), которые осуществляют выраотку антител на различные антигены. днако выработка антител лимфоцитами селезенки на ряд антигенов недостаточна. Поэтому применение вещества, увеличивающего количество клеток в селезенке, позволяет увеличить об- разование и выход антител.

на тимусзависимые антигены, Опыты проведены на 250 мышах-самцах, ли НИИ СВА, весом 18-20 г, которые были разделены на 5 групп. Мьгаам вводилм тимусзависимый антиген (эритроциты барана) в дозе клеток в 1 МП и сутки 3 раза ежедневно подкожно вводили в(ещество из селезенки по 0,1 мг на мышь а также вещества аналогов и прототипа. Затем через 7 дней мышей забивали, брали кровь и определяли общепринятым методом титр антител и количество антителообразующих клеток в селезенке.

Результаты опыта представлены в таблице

Из таблицы следует,что использование вещества из селезенки позволяет значительно (статистически достоверно) увеличить количество антителообразующих клеток и образование и выход антител.

Эти результаты могут быть использованы для повьпиения выхода антител V животных - продуцентов антител при пол5гчении лечебных антисьшороток, что даст большой зкономический эффект. Это в.ещество также можно будет использовать и для введения больным с целью стимуляции образования антител при введении различных вакцин, к которым антитела образуются в недостаточном количестве.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИЗ СЕЛЕЗЕНКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, вклюВСЕСОЮЗНАЯ 4 л. ;:(. , S15..-;4 ., чающий обработку органа ацетоном, его измельчение, получение надосадочной жидкости, обработку ее ацетоном с последующим отделением осадка, его экстракцией и лиофилизацией, о т л и Ч:а ю щ и ис я тем, что, с целью повышения иммуностимулирующей активности, измельченную селезенку экстрагируют в 3%-ном растворе уксусной кислоты при рН 3,0-4,0, в присутствии хлористого цинка, а осадок, полученный после обработки экстракта ацетоном, экстрагируют водой в присутствии зксусной кислоты при рН 6,0-7,0 с последующим фипьтрованием и лиофштизацией. 5

Статистически достоверно по сравнению с контролем (Р- 0,05)