Способ определения повреждений криоконсервированных клеток крови Советский патент 1985 года по МПК G01N33/49 A01N1/02 

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано при низкотемпературном консервировании клеточных суспензий.

Целью изобретения является повышение точности определения.

На чертеже изображена схема выполнения предложенного способа.

В стандартный металлический герметичный контейнер 1 после его запол нения суспензией клеток через специальные герметичные вводы 2, расположенные вдоль продольной оси контейнера, симметрично его центру, в выбранные зоны контейнера вводят иглы 3 заборного устройства. После этого суспензию замораживают. При отогреве замороженной суспензии в полости мерной бюретки 4 заборного устройства создается пониженное давление. В тот момент, когда суспензия на уровне конца заборной иглы 3 переходит из твердого состояния в жидкое за счет разности давлений в контейнере и бюретке, происходит ее всасывание в полость бюретки. Объем взятой пробы контролируют визуальноi

После набора необходимого количества размороженной суспензии из соответствующей зоны контейнера давление .в мерной бюретке устанавливается равньм атмосферному. После взятия проб из выбранных зон объема клеточной суспензии берут общую пробу после полного размораживания всего объе ма. Пробы анализируют и определяют повреждения клеток в каждой из зон и во всем объеме.

Всю процедуру повторяют несколько раз до установления с уровнем достоверности не ниже 0,9 факта наличия или отсутствия различий в повреждении клеток в пробах, полученных из различных зон контейнера и всего размороженного объема в целом. ,

Пример 1. Металлический контейнер 1 объемом 150 мл и расстоянием между стенками 6 мм заполнили эритромассой и через герметичные вводы 2 на расстоянии 50 мм друг от дру га вдоль продольной оси симметрично центру на глубину 1 и 2 мм ввели иглы 3 заборного устройства диаметром 0,3 мм и длиной 25 мм, после чего суспензию заморозили погружением контейнера в жидкий азот. На этапе отогрева контейнер погрузили в водяную баню с температурой +42С, контейнер при этом непрерывно покачивали для обеспечения перемешивания размороженной эритромассы.

После открытия кранов 5 и 6 заборного устройства полость мерной бюретки 4 сообщалась с разреженным объемом, давление в котором было на уровне 0,8 атм. В тот момент, когда на уровне конца заборной иглы 3 замороженная суспенаия эритроцитов перешла из твердого состояния в жидкое, чере иглу 3 за счет разности давлений произошло всасывание размороженной суспензии эритроцитов. После набора

1мл размороженной суспензии из соответствующих зон (с глубины 1 мм и

2мм) краном 5 перекрыли доступ суспензии в бюретку 4, а краном 6 выравнили давление в бюретке 4 с атмосферным. Разрежение в 0,2 атм не приводило к дополнительному повреждению клеток.

После размораживания всего объема суспензии осуществили набор третьей пробы из всего объема контейнера. Всего было 6 повторностей.

Повреждение клеток суспензии эритроцитов определяли по количеству свободного гемоглобина в надосадке проб. Средние данные четырех опытов приведены в таблице.

П р и м е р 2. Повреждения эритроцитов определяли в разных зонах контейнера объемом 300 мм (9 опытов). Способ осуществляли аналогично примеру 1.Полученные данные приведены в таблице.

Содержание свободного гемоглобина в пробах из различных зон контейнера и из объема вцелом приведено в таблице.

Для контейнера объемом 150 мл полученные средние величины уровня свободного гемоглобина в надосадке проб

полученных из первой зоны, второй зоны и 113 контейнера вцелом, достоверно отличаются между собой с уровнем значимости не ниже 0,9. Из таблицы видно, что в контейнере объемом 150 мл гемолиз эритроцитов вначале растет от 85 мг% вблизи стенки в первой зоне до 114% во второй зоне, а затем резко падает, так как если бы повреждения эритроцитов на глубине более 2 мм оставались на уровне .114 мг% или возрастали, общий гемолиз в контейнере не мог уменьшиться 3.116188 до 49 мг%. Так как после глубины 2 мм произошло значительное падение гемолиза, то в центральной зоне контейнера должна располагаться область, в которой гемолиз эритроцитов мини- 5 мален или близок к нулю. Для контейнера объемом 300 мл полученные средние значения гемолиза эритроцитов в первой зоне на глубине 1 мм достоверно отличаются от гемоли-Ю за во второй зоне, и средние значения гемолиза во второй зоне - от значений гемолиза в контейнере вцелом. Во всех случаях уровень значимости 0,9. При имеющемся разбросе отличия в показателях гемолиза в первой зоне и контейнере вцелом незначимы. Это говорит о том, что в контейнере объемом 300 мл показатель гемолиза во всем объеме находится на уровне гемолиза в первой зоне, несмотря на то что во второй зоне гемолиз эритроцитов заметно выше. Эти данные свидетельствуют о том, что в контейнере объемом 300 мл гемолиз также растет по направлению от стенки контейнера к центру от 100 до 188 мг%, а затем sai счет минимального гемолиза в третьей зоне возвращается в контейнер вцелом к показателям гемо- зо ЛИЗа, имеющим место вблизи стенки. fS - В н р ж о

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВРЕВДЕНИЙ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОК КРОВИ путем взятия пробы и расчета сохранности клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, забор пробы осуществляют последовательно по мере размораживания в различных зонах по направлению от периферии к центру.