Способ определения степени повреждения эритроцитов Советский патент 1991 года по МПК G01N33/48 G01N33/48 

СП

С

Изобретение относится к биологии и медицине. Цель изобретения - повышение точности при одновременном расширении возможностей способа. Суспензию исследуемых эритроцитов центрифугируют и определяют концентрацию гемоглобина в надосадочной жидкости. В контрольном (нативном) образце суспензии эритроцитов определяют распределение клеток по объему. Осадок, полученный после центрифугирования, ресуспендируют в плазме и определяют в нем количество клеток, распределение по объему которых идентично распределению клеток по объему в контрольном образце. Затем определяют степень повреждения эритроцитов в процентах по формуле, приведенной в описании. Способ позволяет снизить относительную погрешность определения степени повреждения эритроцитов и проводить определения в средах, содержащих антибиотики.

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для определения степени повреждения эритроцитов после их криоконсервирования или воздействия различных физических и химических факторов, а также при различных заболеваниях.

Цель изобретения - повышение точности способа при одновременном расширении его возможностей.

Способ осуществля ют следующим образом.

Суспензию исследуемых эритроцитов центрифугируют при ЗОООд в течение 5 мин, затем в надосадочной жидкости спектрофото- метрически определяют процент выхода гемоглобина (по отношению к 100%-му лизису). Осажденные в результате центрифугирования клетки ресуспендируют в плазме крови,

так как в ней имеются компоненты (белки, липопротеины), способствующие поддержанию нативной формы эритроцитов. Далее в ресуспендированных эритроцитах определяют количество клеток, распределение по объему которых соответствует распределению по объему эритроцитов, предварительно определенному в контрольной (нативной)суспензии эритроцитов.

С целью нормировки распределений анализу подвергается всегда одно и то же количество эритроцитов, равное 213 шт. Степень повреждения эритроцитов (П) определяют по формуле

п г+ (юо-п -П-щ). %

где Г - процент темолиза клеток;

No количество подсчитанных клеток в ресуспендированном осадке

О

о

GJ СЛ N

ю

Ni - количество клеток, распределение которых по объему идентично распределению по объему в контрольном образце.

Время анализа 13-15 мин,

П р и м е р 1. Эритроциты донорской крови трижды отмывали физиологическим раствором, содержащим 0,15 М NaCI на 5 мМ фосфатном буфере, рН 7,4, после чего инкубировали их в 1,2 М NaCI в течение 10 мин. Затем клетки переносили в изотониче- ские условия(0,15 М №СГ).т1робы центрифугировали 5 мин при 5000д, отбирали надосадок и определяли в нем содержание гемоглобина и инов К+ при помощи калий- селективного электрода. Процент гемогло- бина и ионов К+ определяли по отношению к такому же числу полностью лизировавших клеток поело замораживания до -196°С. Осадок ресуспендировали в плазме крови и определяли процент повреждения клеток Согласно предлагаемому способу. Полученные по 5 экспериментам данные представлены в табл.1.

П р и м е р 2. Отмытые эритроциты помещали в физиологический раствор и ин- кубировали в течение 1 ч при 50 ° С. Затем пробы центрифугировали и проводили измерение процента выхода гемоглобина и ионов К+ так же, как и в примере 1. Полученные данные приведены в табл.2.

Из данных, представленных в табл.1 и 2, видно, что оценка степени повреждения эритроцитов по выходу К в обоих случаях превышает оценку, осуществляемую по выходу гемоглобина. Оценка степени поврежде- ния, проведенная с помощью предлагаемого способа, превышает оценку по выходу калия, что свидетельствует о большей достоверности предлагаемого метода.

Пример 3. В пробирку помещали 1 мл трижды отмытой путем центрифугирования при 5000д в течение 10 мин суспензии эритроцитов (50% на физиологическом растворе) и замораживали без криопротектора со скоростью 300-400°С/мин в жидком азоте до-196°С, Отогрев производили на водяной бане при42°С.

После размораживания образцы центрифугировали при ЗОООд в течение 5 мин, отделяли надосадок и спектрофотометриче- ски на длине волны 543 нм определяли в нем концентрацию свободного гемоглобина. Рассчитывали процент гемолиза эритроцитов по отношению к 100%-му лизису, вызванному добавлением к контрольному образцу детергента тритона Х-100 в концентрации 0,5%. Полученные при центрифугировании осадки ресуспендировали в плазме крови до концентрации клеток 1,5 МО6 кл/мл, измеряли распределение клеток

по объему на приборе Coulter-Counter, Model S. Анализу подвергали 213 клеток как в контрольном, так и в опытном образце. Для контрольного образца брали свежие донорские эритроциты, суспендированные в плазме крови.

Данные по определению степени повреждения замороженных без криопротектора эритроцитов представлены в табл.3.

Из данных, приведенных в табл.3, видно, что распределение по объему ресуспендиро- ванчых в плазме эритроцитов существенно отличается от аналогичного распределения для контрольных клеток. Это указывает на то, что в суспензии ресуспендированных эритроцитов значительное количество клеток повреждено, поэтому суммарная степень повреждения, рассчитанная согласно предлагаемому способу, выше, чем степень повреждения, оцененная только по степени гемолиза эритроцитов. Следовательно, дополнительный учет степени повреждения ресуспендированных эритроцитов повышает достоверность определения степени повреждения эритроцитов.

П р и м е р 4. Замораживание осуществляли аналогично примеру 3 с той лишь разницей, что среда замораживания вместо физиологического раствора содержала кри- опротектор ПЭГ-1500 в концентрации 15%. Определение процента гемолиза и распределения эритроцитов по объему измеряли, как в примере 1.

Данные по определению степени повреждения замороженных в ПЭТ-1500 эритроцитов представлены в табл.4.

Из данных, приведенных в табл.4, видно что степень гемолиза при замораживании под защитой криопротектора значительно меньше, чем без криопротектора, и распределение по объему ресуспендированных эритроцитов в этом случае значительно ближе к контрольному. Поскольку распределение по объему ресуспендированных эритроцитов отличается от контрольного, в этой популяции клеток есть некоторое количество клеток, поврежденных втой или иной степени, что проявляется в набухании и, соответственно, увеличении их объема. Поэтому суммарная степень повреждения эритроцитов, определенная согласно предлагаемому способу, несколько выше, чем определенная только по проценту их гемолиза.

Изобретение позволяет снизить, погрешность определения и проводить определение в среде, содержащей антибиотики.

Формула изобретения

Способ определения степени повреждения эритроцитов, включающий оценку состояния мембран в суспензии эритроцитов опытного и контрольного образцов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности при одновременном расширении области применения способа, определяют распределение по объему клеток в суспензии контрольного образца, затем проводят лизис эритроцитов контрольного образца и определение в нем содержания гемоглобина, суспензию эритроцитов опытного образца центрифугируют, определяют содержание гемоглобина в надосадочной жидкости, осадок эритроцитов опытного образца ресус- пендируют в плазме крови, определяют количество клеток, распределение которых по объему идентично распределению в контрольном образце, а степень повреждения эритроцитов рассчитывают по формуле

(100-Г) (1-JJ1) ,

где П - степень повреждения эритроцитов,

%

Г - степень гемолиза эритроцитов в опытной пробе по отношению к соответст- вующей контрольной пробе, %;

No - количество подсчитанных клеток в ресуспендированном осадке;

NI - количество клеток в ресуспендированном осадке, распределение которых по объему идентично распределению по объему клеток в контрольном образце.

Та бл и ц а 1

Таблица2

ТаблицаЗ