Способ определения механических повреждений криоконсервированных клеток Советский патент 1993 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для определения повреждения клеток при криоконсерви- ровании.

Целью изобретения является повышение достоверности определения механических повреждений криоконсервированных клеток.

Способ поясняется следующим примером.

В сосуд заливают исследуемую суспензию, погружают в термостат и проводяттеп- ловую обработку (охлаждение, нагрев). При возникновении в материале импульсных электрических полей на зонде наводится импульсная ЭДС за счет емкостной связи с теми участками образца, где возникает электрическое поле. Импульсы усиливаются усилителем и регистрируются с помощью регистрирующего устройства. Подавая от генератора импульсы стандартной амплитуды и длительности, перед каждым экспериментом производят калибровку системы

регистрации (усилителя и регистрирующего устройства). Для этого измеряют амплитуду стандартного импульса с помощью регистрирующего устройства и с этими показателямисравниваютимпульсы, регистрируемые при тепловой обработке исследуемого материала. Такой способ регистрации позволяет сопоставлять между собой электрические импульсы в разных образцах или при разных условиях тепловой обработки.

Способ проверяли на экспериментальной установке, которая предназначена для исследования веществ, находящихся в исходном жидком состоянии при комнатной температуре, с последующим охлаждением до-196°С и нагревом. Тонкостенный стакан (толщина стенок 0,1 мм, диаметр 28 мм, длина 70 мм, из нержавеющей стали предназначен для заливки исследуемой жидкости. Для охлаждения образца стакан погружают в сосуд с жидким азотом. Погруженный в раствор зонд представляет собой отрезок

сл

с

00

ю XI

Os

ю

Os

провода во фторопластовой изоляции типа МГГФ-1, длиной 20 мм. Провод погружен в образец изолированной частью, а концы провода находятся над поверхностью жидкости. Таким образом обеспечивается изо- ляция зонда от жидкости по постоянному току. Зонд соединен с усилителем импульсов, собранным на микросхеме К284УЕ1А. Усиленные сигналы подаются на осциллограф типа С1-65А. Зонд соединен также че- рез конденсатор емкостью 1пф с импульсным генератором типа Г5-56. На стенке имеется насадка, в которой расположен термометр сопротивления и нагреватель, соединенные с блоком регулировки и измерения температуры. Импульсные сигналы с выхода усилителя подаются на вход осциллографа и на вход (подсвет). Развертка по оси выполнена по температуре образца. Для этого напряжение, пропорциональное температуре образца, подается на вход осциллографа. Имеется еще одна цепь регистрации записи огибающей импульсных сигналов, состоящая из усилителя импульсов типа УЗ-29, интегри- рующей RC-цепочки и самопишущего потенциометра типа КСП-4.

5 мл донорской крови человека, стабилизированной гемоконсервантом ЦО- ЛИПК-76, центрифугировали, отделяли плазму. Полученную эритромассу смешивали в соотношении 1:1 с криоконсервантом на основе 1,2-пропандиола (35% 1,2-ПД, 3% сахарозы 0,7% NaCI). 1 мл этой смеси помещали в стакан 1 и охлаждали до -196°С погружением в жидкий азот. Скорость охлаждения составляла 100°/мин, нагрева - 70°/мин. В температурном диапазоне от -110°С до -164°С, т.е. от температуры стеклования криозащитного состава, на осцил- лографе наблюдали импульсные сигналы зонда, возникающие в момент образования электрических зарядов в процессе механических разрушений твердоаморфной матрицы.

Отмечено, что электрические сигналы возникают при стекловании жидких микро- фаз и длятся в определенном температурном интервале за счет градиента

температур.

Доказательством того факта, что повреждения биологических объектов в суспензии при низких температурах и возникновение электрических импульсов в них явления взаимосвязанные, могут слу- жить результаты следующего примера. Эритроциты, приготовленные по выше описанной методике, смешивали с пропандио- сахаролем (ПДС) в соотношении 1:1 на основе глицерина (60 мас..% глицерина, 40

5 0 5

0 5 0 5

0

5

мас.% НаО) в отношении 2:1, т.е. две части эритромассы смешивали с одной частью раствора глицерина. Криозащитные среды выбирали таким образом, чтобы наличие электрических импульсов в них в температурном диапазоне tg - 196°C существенно отличалось.

1 мл полученной смеси помещали в стакан 1 и охлаждали до -196°С, затем нагревали до температуры стеклования, и снова охлаждали до -196°С. Циклирование в температурном интервале tg-196°C проводили до 20 раз. Температура стеклования для суспензии эритроцитов с ПДС составляли - 110°С, а для суспензии эритроцитов с раствором глицерина -108°С. После размораживания в водяной бане (+45°С) образцы центрифугировали, определяли свободный гемоглобин в надосадке. При температурном циклирования эритромассы в присутствии ПДС зарегистрировано существенно меньше электрических импульсов, что в таком же эксперименте, но криопро- тектором служил водный раствор глицерина. Как видно из результатов, с ростом количества циклов охлаждения и нагрева в температурной зоне tg4 -196°C увеличивается содержание свободного гемоглобина в надосадке, т.е. растет гемолиз. Этот факт как раз и указывает на повреждение эритроцитов в результате термического воздействия. Гемолиз эритроцитов в криозащитном растворе с глицерином нарастает быстрее, чем в криозащитном растворе с ПДС. Отличия в количестве зарегистрированных электрических импульсов коррелирует с данными по гемолизу. Такие же импульсы мы наблюдали в расторах криопротекторов тех же концентраций, какие получились в приведенных выше примерах, после смешения криозащитных сред с эритромассой. При этом импульсы возникали в растворах криопротекторов в тех же температурных интервалах, что и в суспензиях эритроцитов с добавками криопротекторов вблизи температуры стеклования.

Отсюда можно сделать вывод, что в за- стеклованных микроучастках эритромассы возникают растрескивания, вызывающие электрические поля, которые затем наводят сигналы на зонде. Именно в этом же диапазоне температур возникают повреждения, что видно по нарастанию гемолиза. Таким образом, из всей совокупности механических повреждений, в отличие от прототипа, мы выделили только те, которые приводят к повреждению клеток в области низких температур.

Таким образом, заявляемый способ позволяет непосредственно в образце регистрировать импульсные электрические поля при тепловом воздействии, повысить достоверность определения механических повреждений при криоконсервировании биологических суспензий за счет регистрации растрескиваний в среде нахождения биообъектов.

Формула изобретения

Способ определения механических повреждений криоконсервированных клеток путем регистрации физических параметров, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности определения, регистрируют возникновение электрических импульсов в суспензии клеток.

Изобретение относится к криобиологии и может быть использовано для определения механических повреждений криокон- сервированных клеток. Цель изобретения - повышение достоверности определения механических повреждений криоконсервиро- ванных клеток. Сущность изобретения: в процессе криоконсервирования регистрируют электрические импульсы, возникающие при механических повреждениях клеток. Положительный эффект. Изобретение позволяет непосредственно в образце регистрировать импульсные электрические поля при тепловом воздействии, повысить достоверность определения за счет регистрации электрических импульсов в среде нахождения биообъектов.