Изобретение относится к медицине к проблеме консервиропания, культи- виропания и трансплантации биологических тканей, в частности к консер впропанию костного мозга при ультранизких температурах с целью трансплантации в клинике.
Целью изобретения является повышение качества состава за счет увеличения жизнеспособности стволовых клеток.
Состав раствора для замораживания костного мозга содержит, мае.%; Желатин медицинский 2,0-2,7 Динатриевая соль эти- лeндиaминтeтpay cycнoй кислоты0,09-0,15
Натрий лимонно-киспый трехзамещенный 0,9-1,2 Глицерин6,6-7,4
Диметилацетамид 3,5-А,5 Гемодез (6Х-ный водный раствор поливинил- пирролидона) Остальное Способ приготовления раствора. Взвешивают необходимые навески ингредиентов и растворяют их в такой последовательности. В 1/3 всего объема гемодеза растворяют навески динатриевой соли этилендиаминтетрау сусной кислоты и натрия лимонно-кис лого трехзамещенного. Затем добав- ЛПК1Т необходимые объемы желатина, глицерина и диметилацетамида, после чего добавляют гемодез до нужного окончательного объейа. Определяют рН раствора и доводят его до 7,0- 7,5 с помощью 10 и едкого натра.
Раствор фильтруют и разливают в ctaндapтныe бутылки вместимостью 250 мл и 500 мл по ГОСТ 10782-77. Бутылки укупоривают пробкой из резиновой смеси марки 25-П по ТУ 38-006269-80 и завальцовывают алюминиевыми колпачками по ОСТ 6А-7- 85-79. Затем бутылки завязывают в двойные бязевые мешки. Стерилизуют в автоклаве nffti 1,2 атм (122,7 с) в течение 30 мин 100 мл раствора и А5 мин 250 мл раствора. После стерилизации раствор можно хранить при комнатной температуре или в холодильнике при А-Ю С.
Готопый раствор для замораживания костного мозга представляет собой прозрачную жидкость желтого цвета со глабым специфическим запахом поливинилпиррсч идо}1а.
Раствор хорогпо смешивается с взнесыо костномозговых клеток, предотвращает их конгломерацию, обеспе- чивает морфологическую сохранность ядросодержащих клеток при положительной температуре..
Пример 1. Взвешивают 0,09 г динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,9 г натрия лимон- но-кислого трехзамещенного. В 300 мл гемодеза растворяют эти навески. Затем добавляют 2,00 мл 10%-ного раствора желатина медицинского в ампулах
для инъекций (2,0 мас.Х) 66 мл глицерина и 35 мл диметилацетамида, после чего добавляют гемодез до конечного объема 1 л. Определяют рН раствора 6,6 и доводят его до 7,2 с
помощью 10 н растора едкого натра. Раствор фильтруют и разливают в стандартные бутылки вместимостью 250 МП. Бутылки укупоривают резиновыми пробками, завальцовывают алюминиевыми колпачками, завязывают в двойные бязевые мешки. Раствор стерилизуют в автоклаве при 1,2 атм (l22,7 c) в течение А5 мин.
5 мыией линии (СВАхС57В1б)Р, весом 18-20 г умерщвляют, извлекают бедрен1а 1е кости с помощью шприца, вымывают костный мозг раствором. Взвесь ресуспендируют путем многократного пропускания через и гъекционную иглу, затем фильтруют в стерильный флакоя. Объем взвеси костномозговых клеток в растворе составляет 60 мл. Берут пробу на подсчет для определения количества ядросодержащих клеток и жизнеспособности с помощью суправитального окрашивания водным раствором эозина.
Костномозговую взвесь заливают в два алюминиевых контейнера KB 25808
по 30 мл и направляют на замораживание. Замораживание костного мозга осуществляют по двухзтапной программе: на первом этапе охлаждение камеры аппарата производят со скоРо тью 1 С в минуту от температуры окружающей среды до (при этом температура замораживаемого костного мозга составляет ), на втором - со скоростью Ю С в минуту
до -196°с. Хранение замороженного костного мозга осуществляют в жидком азоте. Оттаивание костного мозга производят быстро в водяной бане с температурой 39-АО С. Берут пробу
на подсчет для определения количест- .ва ядросодержащих клеток н определения жизнеспособности по эозину.
Результаты подсчета в пробах костного мозга до замораживяиия: количество ядросодержа Ц1{х клеток в мл 1,9x10 , количество жизнеспособных клеток 96%.
Результаты подсчета в пробах костного мозга после размораживания количество ядросодержацих клеток в I МП 1,6x10 , количество жизнеспособных клеток 96Z.
Сохранность стволовых кроветворных клеток в размороженном костном моэге определяют с помощью метода клонирования кроветворной ткани в селезенках смертельно облученных мы- шбй. Для этого мышей облучают на усГановке ИПК с источником у-облучения 137сд в дозе 13 Гр прн мощности дозы облучения,О,14 Гр/мин. Через 2 ч после облучення им вводят в хвостовую вену по 0,5 мл взвеси, содержащей 1x10 клеток свежезаготовленного нли размороженного костного мозга. В опыт отбирают мышей весом 20-22г. В первую контрольную группу входят облученные мыши, которым не трансплантируют костный мозг, во вторую контрольную группу - мы- шн, которым вводят клетки свежеза- готовленного костного мозга в тех же дозировках, в третью группу - мьшш, которым трансплантируют размороженный костный мозг.
На 9 день после облучения и трансплантации костного мозга мышей умерщвляют, селезенки извлекают, фиксируют в растворе Бузна и хранят в 10Z-HOM формалине. Подсчет макро- скопнчески видимых колоний проводят под бинокулярной лупой БМ-З1-2 (объектив х7). В первой контрольной труппе количество колоний в селезенке не должно превышать 1,0. Среднее количество колоний, образовавшееся в селезенках мьШ1ей после введения им свежезаготовленного костного мозга, принимают за 1007.,
Результаты исследования сохранности стволовых гемопоэтнческих клеток представлены в табл.1.
Пример 2 (оптимальное соотношение ингредие1 тов) . Взвешивают 0,1 г динатриевой сопи этилендиамин- тетрауксусной киспотц и 1,0 г натрия
лимонно-кислого трехзамощенного.
В 300 мл гемодеза растворяют лтн навескн. Затем добавляют 2-50 мл
10%-ного раствора желатина медицинского в ампулах для инъекций (2,5 мас.%),. 70 мл глицерина и 40 мл диметилацетамида, после чего добавляют гемодез до конечного объема 1 л.
Определяют рН раствора - 6,3, доводят его до 7,5 с помощью 0н раствора едкого натра. Далее раствор фильтруют и стерилизуют, как описано в примере I.
Замораживание костного мозга ьы- шей.
Заготовку костного мозга, замораживание , размораживание проводят как описано в примере I.
Результаты подсчета в пробах костного мозга до замораживания: количество ядросодержапшх клеток в 1 мл - 1,08x10 , количество жизнеспособных клеток - 99Z. Результаты подсчета в
пробах костного мозга после размораживания: количество ядросодержащих клеток в 1 мл 0,92x10, количество жизнеспособных клеток 93Z.
Результаты исследования сохраннести стволовых клетрк представлены в табл. 1.
Замораживание костного мозга человека.
Костный мозг заготовлен у Б.Л.В., пол женский, 20 лет, путем аспирации .из подвздошных костей в стерилышх условиях под общим наркозом на предлагаемом растворе в соотношении 1:1. Чтобы предотвратить гемолиз эритро- цитов в процессе замораживання, предварительно проводят отделение костномозговых элементов от эритроцитов путем отстаивания при комнатной температуре в течение 13 мин.
.
После отделения эритроцитов
взвесь костномозговых клеток помещают в алюгшнневые контейнеры. Замораживание костного мозга проводят по
двухэтапной программе. На первом этапе охлаждение камеры аппарата производят со скоростью в минуту до температуры окружаю цсй срг ды до -9 С, на втором - со скоростью
10 С в мгшуту ДО -19б с. Хрлиеияе
эаморожснного костного мог)га осуществляют и жидком азоте. Оттл:п лниэ костного мозга произлолят Сч. стро и иодлной бане с тсмиературл-й 39-АО С.
Для оценки биологической полноценности криоконсервированного костного мозга использовали метод клони- ропяния кроветворных клеток в полутвердом агаре, позволяющий проводить количественное определение клеток-предшественников в свёжезаго- товлеииом и размороженном костном мозге человека. Метод является лучшим тестом In V {1го,позволяю1цим оценивать результаты криоконсервирова- ния костного мозга человека. К колониям относят клеточные агрегаты, содержащие более 40 клеток, от 3 до 20 клеток - к малым кластерам, от 20 до 40 клеток т « большим кластерам. Количество колоний и кластеров на 1x1 о ядросодержащих клеток в свежезаготовленном костном мозге принимают за 100Z. Подсчет колоний проводят на 14-е сутки культивирования.
Результаты опыта отражены в табл.2.
Пример 3. Взвешивают 0,15 г динатриевой соли этилендиаминтетра- укьусной кислоты и 1,2 г натрия ли- монно-кислого трехзамещеиного. В 300 МП гемодеза растворяют эти на- вески. Затем добавляют 270 мл .10%-ного раствора желатина медицине Кого в ампулах для инъекций Т2,7 мас.%), 74 мл глицерина и 45 мл диметилацетамида, после чего добавляют гемодеэ до конечного объема 1л. Определяют рН раствора 6,7 и доводят его до 7.,4 с помощью Юн раствора едкого натра. Далее раствор фильтруют и стерилизуют как описано в примере I.
Заготовку костного мозга мышей, замораживание, размораживание проводят как описано в примере I.
Результаты подсчета в пробах костного мозга до замораживания: коНижний предел дозировок ингредиентов раствора
Контроль облучения « О
8
личество ядросодержаших клеток в 1 мл 1,3x10, количество жизнеспособных клеток 98%, Результаты под- счета в пробах костного мозга после размораживания: количество ядросодержащих клеток в 1 МП 1,0x10, количество жизнеспособных клеток 97Z.
Результаты исследования сохранности стволовых клеток представлены в табл.1.
Предлагаемый раствор позволяет сохранять более высокий процент стволовых гемопоэтических клеток, что подтверждается выcoки m результатами культивирования размороженного костного мозга человека в полутвердом агаре и клонированием размороженного костного мозга мышей в селезенках смертельно облученных мы- шей.
Формула изобретения
Состав дпя замораживания костного мозга, содержащий глицерин поливи- нилпирролидон, медицинский желатин, этилендиаминтетраацетат натрия и натрий лимонно-кислый трехзамещен- ный, отличающийся тем, что, с целью повышения качества состава за счет увеличения жизнеспособности стволовых клеток, он до- полнительно содержит диметилацета- мид при следующем соотношении компонентов, мас.Х:
Медицинский желатин 2,0-2,7 Этилеидиаминтетрааце- тат натрия0,09-Q,15
Натрий лимонно-кислый трехзамещеиный 0,9-1,2 Глицерин-6,6-7,4
Диметипацетамид 3,5-4,5 6Х-ный водный раствор
поливииилпирролидона Остальное
Таблица I
О
I3A902I
Грутш нышей
Среднее количество колоний на селезенку
Свежеэаготовленный костный мозг
Размороженный костный мозг
Оптимальное соотношение ингредиентов раствора
Контроль облучения .О
-8- О
Свежезаготовленнь й костный мозг
Размороженный костный мозг
Верхний предел дозировок ингредиентов раствора
Контроль облученияО „
Т
Свежезаготовленный костный мозг
Размороженный костный 4озг
8 Продолжение тябл.1
Z с6-хранньп( стволовых
клеток
100 63,3
- .2.0
100
122 . ,0 , ТГ
83.3
129 . 21 5
100
i|3- - п.о
79,1
Изобретение относится к медицине, предназначено для консервирования, . культивирования и трансплантации биологических тканей, конкретно, консервирования костного мозга при ультранизк их температурах с целью трансплантации в клинике. Цель изобретения - повышение качесетва состава за счет увеличения жизнеспособности стволовых клеток. Для этого используют раствор для эамораживания кост.кого мозга следующего состава. КЕСОШЗНАЯ ПАТЕНШ ТсАллЧЕСНАЙ } БИБЛИОТЕКА мас.Х : медицинский желатин 2,0-2,7; динатриевая соль этилендиаминтетра- уксусной кислоты 0,09-0,15; натрий лимонно-кислый трехзамещенный 0,9- 1,2; глицерин 6,6-7,4; диметилацета- мид - 3,5-4,5; гемодез 6%-ный водный растдор поливинилпирролидона остальное. Навески ингредиентов последовательно растворяют. В 1/3 объема гемодеза растворяют навески диНатриевой соли этиле адиаминтетра- уксусной кислоты и натрия лимоннокислого трехзамещенного. Затем добавляют желатин, глицерин, дкметил- ацетамид. Затем добавляют гемодез до нужного окончательного объема, рН раствора доводят до 7,0-7,5 с помощью Юн едкого натра. После фильтрации раствор разливают в стан«- дартные флаконы, стерилизуют. Раствор хорошо смешивается с, взвесью костно-мозговых клеток, предотвра- щает их конгломерацию, обеспечивает морфологическую сохранность ядросо- держащих клеток при положит ьной температуре. 2 табл. о (5 VDEEV
| Состав для криоконсервации миелокариоцитов | 1985 |
|
SU1246967A1 |
