Способ разделения смеси фитогормонов Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 B01D15/08 

медицитны, а именно, к способам получения и разделения фитогормонов регу лирующих процессы роста и развития микроорганизмов, низших и высших рас тений. Целью предложения является ускорение способа и повышение точности разделения. Пример 1.В качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса G-25, силикагеля с люминесцентным индикатором УФ25 крахмала в соотношении 63:15 :14:8 (мас.%). Сефадекс, силикагель, крахмал и целлюлозу последовательно в отдельности суспендируют в деионизированной воде (на 15 г смеси берут 60 мл воды). После суспендирования каждого компонента смеси суспензию размешивают 1 мин. Указанное количество адсорбента достаточно для приготовления 10 пластинок. Для приготовления пластинок со слоем комбинированного адсорбента используют стеклянные обезжиренные фотопластинки (23,7 X 8,7 см). Полученную сорбционную массу наливают на пластинки и сушат в строго горизонтальном положении на воздухе не менее 3 ч. Получают слой толщиной 100 мк. Пластинки активируют при 90 С.в течение 15 ч. Хроматографию фитогормонов проводят при 20-22 С. Растворы наносят MIiкpoшпpицoм. Для хроматографирования фитогормонрв используют подкисленный 80%-ный водный этанольный раствор свидетелей (из расчета 0,5 мл НС1 на 10 мл спирта). На пластинку наносят пробы различных количеств смеси, по 1-3 мкл раствора, содержащего от 17 до 64,5 мкг фитогормонов . После нанесени я растворов стартовую линию подсушивают феном в течение 2-3 шн.

Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере размером 150 X 150 X 200 мм. Расход растворителя составляет примерно 80 мл. Дпя разделения кинетина, индолилуксусной гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана система растворителей н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в соотношении 28:57:5:10 об.%.

Систему растворителей пропускали восходящим током при подъеме ее на 21 см от линии старта. Разделение фитогормонов на комбинированном адИндолилук сус н ая кислота

Гибберелловая кислота

Абсцизовая кислота Кинетин

Пример 2., Свежесобранный растительный материал неоднократно экстрагируют подкисленным 80%-ным метиловым спиртом (из расчета 0,5 мл на 0,1Н НС1 на 100 мл спирта). Растительную вытяжку упаривают до небольшого объема. На готовые пластинки диаметром 23,7 х 8,7 см, покрытие комбинированным адсорбентом (целлюлоза - 69,5; сефадекс - 12,5; силикагель - 11,5; крахмал - 6,5 мае. %), микропшрицом наносят одновременно на стартовую линию растворы анализируемых образцов и свидетелей. Объемы нанесенных раствор&в равняются 1 5 мкл, что является оптимальными объемами.

Отдельно готовят два раствора свидетелей с различным процентным содержанием фитогормонов. Первая смесь тограмму подсушивают феном и выветривают до исчезновения запаха растворителя. Дпя качественного опредег ления фитогормонов используют комбинированный проявитель - слой опрыскивают 0,005%-ным водным раствором флуоресцеина, сушат 2 мин феном, действуют парами брома, освещают ультрафиолетовым светом. Фитогормоны на таких хроматограммах сильно поглощают ультрафиолетовый свет и принимают темно-фиолетовую окраску. Значения R фитогормонов на комбинированном адсорбенте приведены в табл.1, Значения R (х 100) фитогормонов на комбинированном адсорбенте свидетелей объемом 1 мкл содержит 17 мкг (1 мкг индолилуксусной кислоты, по А мкг гибберелловой и абсцизовой кислоты, 8 мкг кинетика). Втррйя смесь свидетелей объемом 1 мкл содержит соответственно 34 мкг фито гормонов (2 мкг индолилуксусной, по 8 мкг гибберелловой и абсцизовой кис лот, 16 мкг кинетина). Хроматографию проводят в герметичной стеклянной камере. После разделения в системе растворителей: н-бутанола, пропанола, аммиака и воды С30:52:6:12 об.%) и проявления пятен на пластинке в принятых условиях проводят количественный анализ фитогормонов. Для этого используют алгебраический метод Пурди и Трутера основанный на зависимости между площадью пятна и его массой. В тычинках цветков яблони зтим методом обнаружи вают на 3 г сьфого материала 5 мкг индолилуксусной, 3 мкг гибберелловой кислоты, 2 мкг кинетина и три не идентифицированных цитокинина. Пример 3. 2г лиофилизированных трехдневных проростков пшеницы экстрагируют подкисленным 80%-ным метиловым спиртом (0,1 л, 3 ч при 20°С), Спиртовой экстракт отделяют от осадка и упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл 95%-ного этилового спирта. На пластинку, покрытую комбинированным адсорбентом: цел люлозой, сефадексом G-25 силикагелем с люминесцентным индикатором УФ 154 и кра хмалом в соотношении 76:10:9:5 мас.%, наносят исследуемый и эталонный растворы. Разделение проводят на комбинированном адсорбенте в системе н-бутанол, пропанол, а;ммиак, вода в соотношении 32:47:7:14 об.%. После проявления пятен 0,005%-ным водным раствором флуоресцеина на пластинке проводят качественный анализ фитогормонов. В проростках пшеницы обнаружены гибберелловая и индолилуксусная кислоты, а также вещество цитокининовой природы . Использование способа позволяет в 18-20 раз ускорить процесс разделения при большей четкости деления. Формула изобретения Способ разделения смеси фитогормонов, включанщий нанесение смеси на адсорбент с последующим разделением в системе растворителей и проявлением в ультрафиолетовом свете, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и повышения точности разделения, в качестве адсорбента используют смесь целлюлозы. сефадекса, силикагеля с люкинесцентным индикатором УФ и крахмала при соотношении ингредиентов, мае. %: Целлюлоза 63-76 Сефадекс10-15 Силикагель 9-14 Крахмал5-8 а система растворителей включаетi H-BuOH, пропанол, аммиак и воду при соотношении, об. %: н-ВиОН28-32 Пропанол47-57 Аммиак5-7 Вода10-14, причем для проявления компонентов слой адсорбента обрабатывают водным. раствором флуоресцеина с концентрацией 0,004-0,005 мае. %, а затем парами брома.

Изобретение относится к медицине, точнее к способам получения и разделения фитогормонов, регулирующих процессы роста и развития микроорганизмов низших и высших растений. Цель изобретения - ускорение способа и повышение точности разделения. Для этого в качестве хроматографического слоя применяют смесь целлюлозы, сефадекса 6-25,сиЛикагеля с люминесцентным индикатором УФ и крахмала, в соотношении