Способ разделения смеси фитогормонов Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

13358792

Изобретение относится к биологии,экстракт взбалтывагс Т на механической

в частности к выделению растительныхкачалке при комнатной температуре в

гормонов (гибберелловой, индолилук-течение 3 ч и снова йыдержизают 18 ч

кислот, цитокининов)и являет- gпри . После центрифугирования при

ся усовершенствованием способа по«0°С (5000 об,/мин в течение, 40 мин)

авт.св. № 1164598. спиртовой экстракт отделяют, а осадок

Цель изобретения - повЬшшние точ-размешивают в 40 мл растворителя и

ности и расширение возможности спо центрифугируют 10 мин при тех же услособа. .10ВИЯХ, Объединенные экстракты отгоняРанее не были известны способы из-ют под струей воздуха от вентилятовлечения фитогормонов из материаловров. Водный раствор ( xQO мл) центриживотных организмов.фугируют при комнатной температуре

Способ осуществляют следующим об-(5000 об./мин в течение 20 мин). К

разом.15центрифугату добавляют равный объем

Лиофилизированный биологическийтолуола, встряхивают, декантируют и

материал.экстрагируют охлажденным доудаляют верхний слой. Эту операцию

5-7 с подкисленном 80%-ным метиловымповторяют дважды.

спиртом (0,5 мл 0,1 н. НС1 на 100 мл Реакцию раствора до рН 9 доводят спирта) при -5-7 С в течение 62-63 ч„ 2020%-ной NaOH, наносят на колонку с Спиртовой экстракт взбалтывают на ка-окисью алюминия, элюируют водой. Из чалке в течение 3 ч при комнатной100 мл элюата белки осалодают концент- температуре, после чего продолжаютрированным раствором уксусно-кислого экстракцию при охлаждении еще 18 ч.свинца, центрифугируют (10 мин при Центрифугируют экстракт при 0°С (при 255000 об./мин), к центрифугату добав- 5000 об./мин в течение 5-10 мин сляют 10%-ный сульфат натрия до пол- последующим повторным центрифугирова-ного удаления катионов свинца и снова нием со свежей порцией растворителя.центрифугируют. Водный остаток под- Растворитель отгоняют под струей воз-кисляют до рН 2 с помощью 5 н. НС1 и духа от вентиляторов, 30трижды фракционируют с равными объеВодный раствор центрифугируют примами (1:1) очищенным серным эфиром,

комнатной температуре при 5000 об/минЭфирные фракции кислых соединений

в течение 15-20 мин, очищают толуоломупаривают досуха, остаток растворяют

и доводят рН раствора до 9-10 добав-в 2 мл 96%-ного этилового спирта и лением раствора щелочи (20%-ной NaOH). g хроматографируют фитогормоны в соотИз раствора сначала удаляют жирныеветствии с основным способом, кислоты, аминокислоты, дигменты, ка- В качестве хроматографического

тионы и другие соединения на колонкеслоя применяют смесуэ целлюлозы, сефас окисью алюминия, затем осаждаютдекса G-25, силикагеля с люминесцент- белковьре вещества концентрированным о индикатором УФ2у4 крахмала при

раствором уксусно-кислого свинца,массовом соотношении 63:15:14:8. Сецентрифугируют 10 мин при 5000 об./мин,фадекс, силикагель, крахмал и целлюлодобавляют к центрифугату 10%-ный суль-зу последовательно в отдельности сусфат натрия до полного удаления катио-пендируют в деионизированной воде (на нов свинца и снова центрифугируют. д 15 г смеси 60 .мл воды). После суспенЦентрифугат подкисляют 5 н, НС1дирования каждого компонента смеси

до рН 2-2,5 и фитогормоны извлекаютсуспензию размешивают 1 мин. Указан2-3 раза равными объемами (1:1) очи-ное количество адсорбента достаточно

-ценного серного эфира. Объединенныедля приготовления десяти пластинок, зытяжки серного эфира упаривают в то- ц... Для приготовления пластинок со слоем

ке воздуха досуха, остаток растворяюткомбинированного адсорбента использув 2 мл этилового спирта и хроматогра-ют стекляные, тщательно обезжиренные

фируют в тонком слое адсорбента вфотопластины (23,7x8,7 см). :;оответствии с основным способом.Полученную сорбционную массу налиПример 1, 5 г лиофилизирован-вают на пластинки и сушат в строго ного луба виноградной лозы экстраги-горизонтальном положении на воздухе руют подкисленным 80%-ным метиловымне менее 3 ч, что обеспечивает полуспиртом (0,3 л, 62 ч) при температу-чение слоя 100 мкм. Пластинки активи- De -7°С (в холодильнике). Спиртовойруют при 90 С в течение 15 ч. Хрома-.

тографию фитогормонов проводят при 20 С. Растворы наносят микрошприцем. Для хроматографирования фитогормонов используют подкисленный 80%-ный водный этанольный раствор (из расчета 0,5 мл НС1 на 10 мл спирта). На пластинку наносят пробы различных количеств смеси по 1-3 мкл раствора, содержащего 17-64,5 мкг фитогормонов. После нанесения растворов стартовую линию подсушивают феном в течение 2-3 мин.

Хроматографию проводят в герметической стеклянной камере размером 150x150x200 мм. Расход растворителя составляет- вО мл. Для разделения кине- тина, индолилуксусной, гибберелловой и абсцизовой кислот подобрана система растворителей н-бутанол, пропанол, аммиак, вода в объемном соотношении 28:57:5:10.

Систему растворителей пропускают восходящим током при подъеме ее на

10

Пример 2. 10 мл сыворотки крови человека фиксируют жидким азотом и растирают до порошкообразного состояния, экстрагируют 400 мл подкисленного 80%-ного метилового спирта 60 ч при -5°С. После взбалтывания спиртового экстракта на механической качалке при 22 С в течение 3,5 ч снова выдерживают 18 ч при низкой температуре. Экстракт центрифугируют при О С (5000 об./мин в течение 35 мин), отделяют спиртовой экстракт и осадок размешивают в 40 мл подкисленного ме- Ig тилового спирта и центрифугируют 10 мин при той же температуре.

Объединенные спиртовые экстракты отгоняют в токе воздуха и оставшиеся 115 мл водного раствора центрифугируют при 20 С (5000 об./мин в течение 20 мин). К центрифугату добавляют 120 мл толуола, встряхивают 3 мин и декантируют. Промывку со свежей порцией толуола повторяют еще раз. Дово- 21 см от линии старта. Разделение фи- 25 Дят реакцию раствора до рН 1020%-ной тогормонов на комбинированном адсор- NaOH, пропускают через колонку с бенте происходит за 2,5 ч. Хромато- окисью алюминия и элюируют 25 мл во- грамму подсушивают феном и выветрива- ды. Белки из 140 мл элюата осаждают ют до исчезновения .запаха растворите- 15 мл концентрированного раствора ук- ля. Для качественного определения фи- Q сусно-кислого свинца, центрифугируют тогормонов используют комбинированный 15 мин при 5000 об,/мин и к центрифу20

проявитель. Слой опрыскивают 0,005%-ным водным раствором флуорес- цеина, сушат 2 мин феном, действуют парами брома, освещают ультрафиолетовым светом. Фитогормоны на таких хро- матограммах сильно поглощают ультрафиолетовый свет и принимают темно- фиолетовую окраску.

Значения R фитогормонов на комбинированном адсорбенте приведены в таблице.

R хЮО (Растворитель: н-бутанол, пропанол,аммиак, вода 28:57:5:10, об. %)

Кинетин

Индолилуксусная кислота

Гибберелловая кислота

Абсцизовая кислота

10

Ig

25 Q

20

5

0

гату добавляют 13 мл 10%-ного сульфата на.трия.

Водный остаток подкисляют до рН 2,5 с помощью 5 н.НС (рН раствора проверяют с помощью универсальной индикаторной бумаги) и фракционируют не менее трех раз равными объемами очищенного серного эфира. Эфир удаляют в токе холодного воздуха, а сухой остаток растворяют в 2 мл 96%-ного спирта. Спиртовой раствор фильтруют через стеклянную вату и хроматографи- руют по примеру 1.

Пример 3. 30 мл бычьей спермы фиксируют жидким азотом и растирают до порошкообразного состояния, экстрагируют 400 мл подкисленного 80%-ного метилового спирта 60 ч при -6°С, После взбалтывания спиртового

экстракта при 22°С в течение 3,5 ч снова выдерживают 18 ч при низкой температуре. Экстракт центрифугируют при О С (5000 об./мин в течение 40 мин), осадок размешивают в 40 мл раствори5 теля и центрифугируют 10 мин при тех же условиях.

Объединенные спиртовые экстракты отгоняют в токе воздуха и оставип еся

5

1

120 MJi водного раствора центрифугируют при 20°С (5000 об./мин в течение 20 мин). Трижды промывают центрифуга равными объемами толуола, Доводят реакцию раствора до рН 9,5 20%-ным раствором NaOH, пропускают через колонку с окисью алюминия и элюируют 25 мл воды.

Белки из 140 мл элюата осаждают 20 мл концентрированного раствора уксусно-кислого свинца, центрифуги- .руют 20 мин при 5000 об,/мин и к центрифугату добавляют 15 мл 10%--но- го сульфата натрия. Водный остаток подкийляют до рН 2,25 с помощью 5 н ИС1„ Экстракт доводят до хроматогра- фирования по примерам 1 и 2.

Такпм образом, предлагаемый спосо дает возможность выделить фитогормо

ор П. Гереши 4042/38

Составитель И, Тареева Техред В.Кадар

Корр Подп

Тираж 776 ВНИИПИ ГосударстЕ енного комитета СССР

по делам изобретений и открытий Г13035,;, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие,г. Ужгород, ул. Проектная, 4

6

ны как из растительного, так и из . животного сырья в большем количестве по сравнению с известным способом и значительно сэкономить органи - ческие растворители Гэтилацетат , толуол.

I

Формула изобретения

Способ разделения смеси фитогор монов по авт.ев, № 1164598, о т л и

повышения точности и расширения воз- Можностей способа, перед нанесением смеси на адсорбент, экстракт подщелачивают до рН 9-10, добавляют раствор уксусно-кислого свинца, подкисляют до рН 2-2,5 и экстрагируют серным эфиром.

Корректор И. Муска Подписное

Изобретение относится к области биологии, в частности к выделению растительных гормонов. Целью изобретения является повышение точности и расширение возможностей способа. Способ заключается в том, что лиофи- лизированный биологический материал экстрагируют метиловым спиртом.Раст- веритель отгоняют. Водный раствор центрифугируют, очищают толуолом и доводят рН раствора до 9-10 добавлением раствора щелочи. Из раствора сначала удаляют жирные кислоты,аминокислоты, пигменты, катионы и др. соединения на колонке окиси алюминия, затем осаждают белковые вещества концентрированным раствором уксуснокислого свинца, центрифугируют, добавляют к центрифугату 10%-ный сульфат натрия до полного удаления катионов свинца и снова центрифугируют. Цент- рифугат подкисляют 5 н.НС до рН 2- 2,5 и фитогормоны извлекают 2-3 раза равными объемами (1:1) очищенного а серного эфира. Затем проводят хромато- графию на адсорбенте. Фитогормоны проявляют путем опрыскивания раствором флуоресцеина с последующим воздействием парами брома и освещением ультрафиолетовым светом. 1 табл. (Л 00 00 СП 00 го