Способ определения абсцизовой кислоты в тканях растений Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 

1

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения абсцизовой и индолил-З-ук- сусной кислот в тканях растений методом хроматографии в тонком слое.

Целью изобретения является повьшш- ние эффективности способа и одновременное определение абсцизовой и индолил-3-уксусной кислот.

Способ осуществляется следующим образом.

1 г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала экстрагируют трижды в течение 1 ч при по 10 мл 80%-ного водного ме

танола. Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 35-40°С. Сухой оста- ток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля на алюминиевой или пластиковой подложке в промежуток между двумя направляющими. Размер нагграв- ляющих,5-6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 8-10 мм. й{идкость из микрошприца подается равномерно со скоростью, позволяющей раствору самопроизволь- но распространяться по площади, ограниченной направляющими. Пластинку помещают в хроматографическую каме- ру, содержащую 12,5%-ный водньш аммиак , и хроматографируют до пр;тьема фронта растворителя на высоту 4-5 см После высушивания пластинки и удаления аммиачного запаха отрезают ниж- нюю часть пластинки параллельно ее нижнему краю на расстоянии 1-2 мм выше пигментированной зоны. Верхнюю часть пластинки помещают в хроматографическую камеру и разделяют в сие теме хлороформ - уксусная кислота (20:3). После подъема растворителя н высоту 12-13 см пластинку, высушивают поворачивают на 90° , в левом углу наносят количественно стандартные растворы абсцизовой и индолил-3-ук- сусной кислот в известной концентрации, проводят хроматографирование в НОВОМ направлении в свежеприготовленной системе хлороформ - уксусная .кислота (20:3). Количественное опре- деление проводят методом спектроден- ситометрии при длине волны 280 им.

330522

Количественный расчет производится методом абсолютной калибровки при использовании в качестве стандартных веществ абсдизовой и индолил-3-уксус- ной кислот.

Изменение условий нанесения образца, в частности размеров направляющих и расстояния между ними, а также концентрации водного a миaкa, оказывает влияние па конечный результат.

Пример 1. 1 г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего . 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолш1-3-уксус- 5 ной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5°С по 10 мл 80%-но- го водного метанола, Объединеннь й

10

метанольный экстракт фильтруют и уваривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно перенос.зт 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слое.м силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером 6 см в длину перпендикулярно нижнему . краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 10 мм. Хроматографирование проводят в 5%-ном , водном аммиаке на высоту подъеьга

фронта растворителя 5 см. Дальнейший ход анализа аналогичен описанию осуществления способа. Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 21,4 и для индолил-3-уксусной кислоты 29,6.

Пример 2. 1г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-3-ук- сусной кислоты, экстрагируют трижды в течение I .ч при по 10 мл 80%- ного водного метанола. Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером б см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 10 мм. Хроматографирование проводят в 12,5%- ном 1зодном аммиаке. Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 73,5 и для индолил-3-уксусной кисл о- ,7.

3

Пример 3, 1г фиксированно Ж1ЩКИМ азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсци- зовой кислоты и 5 мкг индолш1-3-ук- сусной кислоты, экстрагируют трижды в течение I ч при 5°С по 10 мл 80%- ного водного метанола. Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером 6 см в длину перпендикулярно ниж нему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 10 мм. Хроматографирование проводят 25%-ным водным аммиаком. Процент определения составляет для абсдизовой кислоты 51,2 и для индолил-3-уксусно кислоты 59,4.

25

30

3- 40

Пример 4. 1г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-3-уксусной кислоты, экстраги руют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80%-ного водного метанола. Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на 35 пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими размером 3 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направ ляющими 10 мм. Ход анализа аналогичен описанному в примере 2. Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 10,2 и индолил-З-уксусной кислоты 13,7.

Пример 5. 1г фиксированного жидким азотом свежех о растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-З-уксусной кислоты, экстрагируют триждаг в течение 1 ч при 5°С по 10 мл 80%- ного водного метанола. Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 35-40 С, Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в проме45

50

55

to

о - f5 й

20

25

30

40

35 н

жуток между двумя направляющ1-гми размером 8 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 10 мм. Дальнейший ход анализа аналогичен описанному в примере 2, Процент определения Составляет дпя абсцизовой кислоты 59,6 и индолил-З-уксусной кислоты 68,3,

Пример 6, 1г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг,индолил-3- -уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80%-ного водного метанола. Объединенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 45-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с тонким слоем силикагеля в промежуток между двумя направляющими мером 6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 5 мм, Дальнейщий ход анализа аналогичен описанному в примере 2, Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 7,3 и для индолил-3-ук - . сусной кислоты 13,2.

Пример 7, 1г фиксированного жидким азотом свежего растительного материала, содержащего 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-З-уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80%- го водного метанола. Объ,единенный метанольный экстракт фильтруют и упаривают под вакуумом при 35-40 С. Сухой остаток растворяют в 100 мкл метанола и количественно переносят 50 мкл этого раствора на пластинку с TOHKHI I слоем силикагеля в промежуток между 45 двумя направляющими размером 6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки в левом углу с расстоянием между направляющими 15 мм. Дальнейший ход анализа аналогичен описанному в примере 2, Процент определения составляет для абсцизовой кислоты 35,9 и для индолил-3-уксусной кислоты48,, I . В табл,1 приведено влияние изменения условий нанесенкя образца и концентрации водного аммиака на полноту определения абсцизовой и индолил-3- -уксусной кислот в растительном образце (на примере 5 мкг кисдют) ,

50

55

.

Результаты показывают, что опти- мальными условиями нанесения образца являются длина направляющих 6 см, расстояние между направляющими 10 мм а оптимальной концентрацией для хро- матографирования в первой системе является 12,5%-ный водный аммиак,

В данных условиях очистки растительного экстракта количественно оп ределяются абсцизовая и индолип-3-ук- сусная кислоты в различных растительных образцах.

Пример 8. 1г фиксированной жидким азотом колеоптилей пшениць, содержащий 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-З уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5 С по 10 мл 80%-ного водного метанола. Дашьнейший ход анализа аналогш4ен описанному в примере 2„ Полнота определения составляет для абсцизовой кислоты 72,5 и для индолил-3- -уксусной кислоты 83,3.

Пример 9. 1г фиксированных жидким азотом проростков кукурузы.

Таблица

40

35

45

содерн аш,ий 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил 3-уксусной кислоты, экстрагируют трижды в течение 1 ч при по 10 мл 80%-ного водного метанола . Дальнейший ход анализ а аналогичен описанному в примере 2. Полнота определения составляет для абсцизовой кислоты 87,5 и для индолил-З- -уксусной кислоты 88,0.

Пример 10. 1 г фиксированных жидким азотом листьев подсолнечника, содержащий 5 мкг абсцизовой кислоты и 5 мкг индолил-3-уксусной кислоты,, экстрагируют трижды в течение 1 ч при 5°С по 10 мл 80%-ного водного метанола. Дальнейший ход анализа аналогичен описанному в примере 2„ Полнота определения составляет для абсцизовой кислоты 53,1 и для индолил 3-уксусной кисло1Ъ1 68,8.

Из табл.2 следует, что полнота определения кислот предлагаемым способом в 1,5-2 раза выше, чем известным ,

Кислота

32,2

39,8

Иэ приведенных примеров видно, что предлагаемый способ повышает полноту определения абсцизовой и ин- 1долш1-3-уксусной кислот в тканях рас- тений.3Q

Формула изобретения

Способ определения абсцизовой кислоты в тканях растений путем экстракции из растительной ткани органическим растворителем, удаления твердой фазы, концентрирования жидкой фазы .с последующей очисткой кислоты из концентрата двукратной хроматографией в тонком слое сорбента на пластине, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа и одновременного определения индолил-3-уксусной кислоты, перед на- несением концентрата на сорбент при - первой стадии хроматографирования на

Редактор Р.Цицика

Составитель И.Тареева

Техред о.Сопко Корректор М.Самборскдя

Заказ 2763/46 Тираж 778Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий П3035, Москву, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Таблица 2

Полнота определения, %

72,5

87,5

53,1

83,3

88,0

68,8

сорбенте наносят направляющие в виде двух параллельных борозд путем удаления сорбента, при этом длина бороэ- ды 5-6 см, а расстояние между ними, 8-10 мм, на первой стадии используют систему растворителей в виде Ш-15%- ного водного раствора аммиака до f подъема его на высоту 4-5.см с последующим удалением коэкстрактивных веществ с пластины, на второй стадии хроматографии полученное пятно кислот хроматографируют в том же направлении, при этом в качестве системы ; растворителей используют хлороформ - уксусную кислоту до подъема растворителя на высоту 12-13 см, причем пятно, полученное после второй стадии, дополнительно хроматографируют в системе растворителя, используемого на второй стадии,приповороте пластинына 90 ,аколичественное определениеосуществляют методомспектроденситометрии.

Изобретение позволяет одновременно определять абсцизовую и индр- лил-3-уксусную кислоты путем экстрагирования растительного материала в водном метаноле с упариванием экстракта. После растворения в метаноле сухого остатка его наносят на пластинку (П) со слоем силикагеля на подложке в промежуток между направляющими, размер которых 5-6 см в длину перпендикулярно нижнему краю пластинки с расстоянием между направляющими 8-10 мм. П помещают в содержащую 10- 15%-ный аммиак хроматографи- ческую камеру и хроматографируют до подъема раствора аммиака на высоту 4-5 см с последующим удалением отрезанием нижней части П параллельно ее нижнему краю на расстоянии 1 -2 м выше пигментированной зоны. На второй стадии верхнюю часть П хроматографи- руют в том же направлении с хлороформ- уксусной кислотой в качестве растворителя до подъема его на высоту 12- 13 см. После этого П высушивают, поворачивают на 90 и хроматографируют в растворителе второй стадии. Количественную оценку осуществляют методом спектроденситометрии. 2 табл. (Л с со со о ел ьэ