Способ количественного определения зеараленона в тканях животных Советский патент 1980 года по МПК G01N31/08 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам количественного определения микотоксина Ф-2-зеараленона лактона б-(10-оксй -б-йксо-транс-1-ундеценил) р -резорциновой кислоты в тканях животных.

Известен способ определения микотоксинов в кормах, заключагацийся.в обработке анализируемой пробы хлороформом с последующей обработкой хлороформного слоя гексаном и бензолом, дальнейшей очисткой на колонке, заполненной силикагелем, и хромато- графированием остатка в тонком слое силикагеля 1.

Таким способом невозможно определить зеараленон.

: К предлагаемому способу наиболее близок способ количественного определения зеараленона в тканях животных, заключающийся в обработке анализируемой пробы хлороформом, очистке полученного раствора на колонке, запелненной силикагелем, с последующим элюированием зеараленона смесью бензола и ацетона, концентрировании элюата с хроматографированием концент рата в тонком слое силикагеля 2.

Недостатками такого способаявляются низкие чувствительность (0, 5 . / мг/кг)и избирательность определения.

Целью изобретения является повышение избирательности и чувствительности определения.

Цель достигается способом количесвенного определения зеараленона в тканях животных, заключающимся в обработке анализируемой пробы ацетоном очистке полученно1го раствора на колонке, заполненной окисью алюминия, с элюированием зеараленона смесью ацетона и воды, взятых, в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1, концентрировании элюата и хроматографировании концентрата в тонком слое силикагеля с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитро- , фенилдиазойий тётрафторборатом.

Отличием предлагаемого способа является использование в качестве органического растворителя ацетона, 3 качестве адсорбента окиси алюминия 1раведение элюирования смесью ацеточа и воды, взятых: в объемном соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1 и, последующая обработка тонкослойной хроматогграммы п-нитрофенилдиазоний тетрафторборатрм. Пример . Для определения эеараленона 10- г гомогенизированного .образца (мышечная ткань, печень,почки, кровь, патологический материал) вносят в колбу емкостью 250 мл. Зате в нее вливают 60 мл ацетона и встряхивают на игуттель-аппарате в течение 2 ч. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу с притертой пробкой. Извлечение токсина повторяют, используя еще 60 мл ацетона. Объединенный экстракт переносят в фарфоровую чашку 13 и выпаривают на кипяп ей водяной бане досуха. Получен ный остаток очищают от коэкстрактивных веществ на колонке окиси алюмини П степени активности для хроматографирования. Колонку для хроматографирования готовят следующим образом. В нижнюю часть колонки помещают тампон ваты высотой 1 см, затем вносят 5 г окиси алюминия и промывают колонку 20 мл ацетона квалификации о.с.ч.,х.ч. или после дистилляции. Остаток в чашке после выпаривания элюата.растворяют в 20 мл ацетона и вносят в колонку. После того, как экстракт опустится до верхнего края столбика адсорбента, через колонку пропускают 150 мл чистого ацетона и затем 50 мл ацетона, содержащего 1% воды. Токсин элюируют 50 мл смеси ацетон-дистиллированная вода (9 si по объему). Элюат собирают в чашку № 10 и выпаривают на водяной бане досуха. Ост.Чток в чашке растворяют в 30 мл ацетона и фильтруют через бумажный фильтр в чистую фарфоровую чашку 10. Фильтрат выпаривают на водяной бане досуха. Полученный после выпаривания раст ворителя остаток в чашке растворяю в 1 мл бензола и полностью в 2-3 при ема наносят на пластинку силуфола микропипеткой, используя струю горячего воздуха. Одновременно готовят свидетели т.е. наносят на плйстинку 10; 20; 30; 50 и 100 мкл раствора зеараленона в бензоле, что соответсггвует 1;2;3;5 и 10 мкг зеараленона и выпаривают растворитель. Образцы наносят на пластинку в/следующей последовательности: повторность, свидетели, 2 повторность. Размер пятен не должен превышать 0,5 см. Места нанесения проб располагают на расстоянии 1,5-2 см от нижнего и боковых краев пластинки и друг от друга. В камеру для хроматографирования вносят 100 мл смеси гексана и диэтилового эфира (в соотношении 1:3 по объему) и через 20 мин помещ ют пластинку в вертикальном положени после того как растворитель поднимется на высоту 10-12 см, пластинку вынимают, отмечают фронт растворите ля и помещают в сушильный шкаф HS 3 мин при 105 С. Затем пластинку опрыскивают, свежеприготовленным 0,05%-ным раствором прочного красного Ж в 50%-ном этаноле и снова помещают в сушильный шкаф при этой же температугма на 5-7 мин. Зеараленон проявляется в виде ярко желтого пятна на белом фоне с R 0,47 + 0,01. Количество токсина в пробе определяют, сравнивая интенсивность окраски и площадь пятен свидетеля и образца. В случае, если содержание микотоксина в пробе превышает 10 мкг, то получают хроматограмму стандартов большей концентрации (10-20 мкг). Концентрацию Ф-2 в образце рассчитывают по формуле: А У : - -, , где X - содер)1;аниё зеараленона в исследуемой пробе, мг/кг; А - количество токсина в навеске, мкг ; Р - вес пробы, г. Чувствительность определения зеараленона в органах и тканях животных при навеске 10 г составляет 100 мкг/кг (0,1 мг/кг). Абсолютная чувствительность обнаружения стандартного вещества в тонком слое силикагеля (силуфола) составляет 0,25 мкг. Степень извлечения зеараленона зависит от соотношения между массой образца и объемом органического раЪтворителя, а также от времени экстракции. Если 10 г пробы встряхивать в течение 2 ч с 60 мл ацетона, то извлечение-Ф-2 составляет 45-«:3%. Увеличение времени экстракций повышает выход токсина только на 5-7%. Двукратная обработка проб ацетоном порциями по 60 мл повышает извлечение зеараленона до 75-80%, а при дальнейшей экстракции выход токсина возрастает незначительно (до 82-85%). Причем аналогичная обработка проб хлороформом приводит к извлечению не более 60% токсина. Установл ено, что зеараленон прочно удерживается на колонке окиси алюминия. Применение силикагеля было малоэффективным из-за мешающего влияния коэкстрактивных веществ и слабой адсорбции зеараленона. При этом значительную роль играет элюент. Так, при десорбции зеараленона смесью ацетона и .уксусной кислоты происходит разложение токсина и вьвквание большого количества мешающих анализу веществ, Элюирование ацетоном с добавкой пщроксида натрия также приводит к одновременной десорбции коэкстрактивных веществ. Наиболее приемлемым элюентом является смесь ацетона и дистиллированной воды в соотношении 8,9-9, 05; 0,95-1,1, При меньшей содержании воды в ацетоне десорбции Ф-2 практически не происходит, или она очень слабая, а при высоком соотношении между ацетоном и водой на результаты анализа влияют коэкстрактивные вещества. Масса адсо,рбен: а в колонке оказывает действие на адсорбцию токсина и других соединений. Испытаны колонки с 2, 3, 5, 7 и 10 г окиси алюминия. Наилучшие результаты по степени десорбции Ф-2 и удерживания примесей получены с массой адсорбента, равной 5г. С целью избирательного определени зеараленона испытаны различные реакции с образованием окрашенных комплексов. Установлено, что Ф-2. проявляет свойства фенола, вступая в реак ции сочетания с 4-аминоантипирицом, дназореактивами, реагирует с реактивом Фолина-Чокальтеу. Однако чувствительность обнаружения Ф-2 посредст вом 4-аминоантипирина и реактива Фолина-Чокальтеу не превышает 3-5.мк Ф-2 наиболее четко проявляется диазо реактивом -п-нитрофенилдиазоний. тетрафторборатом. При этом на белом фоне пл,астинки наблюдают ярко желтые компактные, не обесцвечивающиеся при хранении хроматограг/ мы пятна вещества без мешающего влияния коэкстрактивных веществ. Интенсивность окраски пятен возрастает в интервале 0,25-20 мкг, а минимально определяемое количество микотоксина в тонком слое силикагеля оказывается равным : 0,25 мкг. Чувствительность обнаружения зеараленона в тканях животных достигает 100мкг/кг, что в 5 раз выше по сравнению с известным способом. При облучении хроматограмм, полученных по предлагаемому способу, УФ-светом (256 им) не наблюдают флуоресцирующих пятен, за исключением зон, соответствующих Ф-2, в то время как при. экспозиции к УФ-свету (256 нм) хроматограмм, полученных по известному способу, проявляется множество пятен, флуоресцирующих голубым, синим и зеленым цветом, а идентификация зеараленона становится невозможной. При этом свидетель-зеараленон после вторичного оёлучения не флуоресцирует. Преимущества способа согласно изобретению по сравнению с известным приведеныв таблице.

Мышечная ткань

0,05 кролика, 10 г

кролика,

0,05 0,10 0,50 1,00

кролика. Юг

0,05 0,10

0,50 1,00

Формула изобретения Способ количественного определения зеараленона в тканях животных путем обработки анализируемой пробы органическим растворителем, очистки

Не обнаружен Не обнаружен Не обнаружен

.Не обнаруженНе обнаружен Не обнаружен

То жеТо же О, 07

- -0,40 0,35

Следы 0,80 0,80

Не обнаружен Не обнаружен То же 0,07 0,50 0,40

0,80

1,00

полученного раствора на,колонке, заполненной адсорбентом, с последующим элюированием зеараленона, концентрированием элюата и хроматографированием концентрата в тонком слое, от7 :72647 ли чающийся тем, что, с целью повышения избирательности и чувстви: TenbMocfH определения,.в качестве органического растворителя испольэуют ацетон, в качестве адсорбента- окйСь алймнния и элюирование прово-, дят смесью ацетона и воды, взятых в рб емнрм соотношении 8,9-9,05:0,95-1,1, с последующей обработкой тонкослойной хроматограммы п-нитрофенилдиазоНИИ тетрафторборатом.... 9 8 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе V . 1. Авторское свидетельство СССР 389446, кл. G 01 N 31/08, 1973, опублик. 2, R. W. Eppley,Screeming method for F-2, aflatoxins and pchratoxin, j. Association office Analytical CKemists, vol 51, 1, p. 74, 1968 (прототип) .