Способ стимуляции иммунного ответа @ @ Советский патент 1986 года по МПК A61K39/00 

to

О

к

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, а именно к способам усиления иммунного ответа в культуре клеток (ин витро) in vitro.

Целью изобретения является усиление антителообразования клеток селезенки в культуре тканей с помощью F(ab)- -фрагмента иммуноглобулина G.

Пример 1. Получение пептида

F(ab)2-фрагмент получают перевариванием IgG кролика пепсином в 0,05 М ацетатном буфере на 0,15 М NaCl, рН 4,1 в течение 18 ч при 37 С Соотношение фермент-субстрат 1:50. Полученный гидролизат диализуют против 0,15 М NaCi, подвергают хроматографии на колонке с сефадексом Г-200 и концентрируют на системе Amicon с использованием фильтра РМ-10.

Полученный F(ab Фрагмент диализуют против 0,15 М NaCt рН 7,0 в течение 24 ч при 4°С. Концентрация белка составляет 10 мг/мл, объем 3 мл. К раствору фрагмента добавляют папаин, 3-кратно перекристаллизованный в 0,05 М фосфатном буфере рН 6,8, содержащем 0,01 М 2-меркаптоэтанол (Serva). Соотношение фермент-субстрат составляет 1:50. Смесь инкубируют при в течение 10 ч, затем папаин инактивируют добавлением 0,05 М монойодацетата натрия с последующей инкубацией пробы при 20° С в течение 1 ч. Гидролизат пропускают через мембранный фильтр (Diaffo РМ-10 (Amicon). Фильтрат концентрируют с помощью мембранного фильтра DiafEo ИМ-0,5 (Amicon). Оставшийся над фильтром материал исследуют биуретовым методом- на содержание пептида (пептидов), используя в качест ве стандарта дипептид глицил-лейцин. Количество полученного низкомолекулярного стимулятора составляло

250 мкг.

Постановка основного опыта. Клетки селезенки (5 млн/мл) культивируют в среде RPMI-1640 с 10%ной аутологичной сьшороткой и в присутствии 5-10 М меркаптоэтанола

и глютамина. В каждую культуру вносят по 2,5-10 эритроцитов барана. В опытные культуры дополнительно вносят по 5 мкг полученного продукта.,

который предварительно стерилизуют путем фильтрации через милипоровый фильтрС8и-р02500,С50,22М.В другие культуры клеток селезенки кролика вносят по 500 мкг F(ab)2 Фрагмента

или по 500 мкг высокомолекулярного продукта гидролиза F(ab )-фрагмента папаином, выделенного при хроматографии гидролизата на сефадексе Г-25 (папаиновый Fab-44 arMeHT) . В контрольные культуры добавляют только эритроциты барана. Все культуры ставят в термостат при 37 С в атмосфере 95% воздуха плюс 5% СО. Через 5 сут. определяют число антителопродуцирующих клеток по прямому методу локального гемолиза в геле агара.

Положительный эффект изобретения подтверждается , приведенн{ о4и в таблице.

Таким образом, предложенный способ позволяет увеличить антителообразование в культуре клеток селезенки в 100 раз по сравнению с ранее известным.

Способ имеет практическое значение в био.технологии при разработке метода получения антител в больших масштабах. .

312021084

Зависимость количества антителопродуцирующих клеток от типа и концентрации

фрагмента

СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ИММУННОГО :ОТВЕТА IN VITRO, включающий одновременное добавление в культуру клеток селезенки кролика антигена и иммуностимулятора с последующим учетом количества антителообразующих клеток, отличающийся тем, что, с целью усиления антителообразования, в качестве иммуностимулятора используют пептид с мол.м.500-2000 дальтон, полученный в результате протеолиза папаином фрагмента иммуноглобулина р. щ

+ ч- +

1 ±0,6 8 ± 3,5 29 2,3

500 121 1,7 500 51 ± 7,8 5