ИММУНОДЕПРЕССАНТ Российский патент 1995 года по МПК A61K31/04 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушением системы иммунитета.

Известно применение нитрозопиридинолов для повышения прочности резин, получаемых из хлорпропенового каучука, и увеличения скорости вулканизации резиновой смеси. Однако иммуномодулирующие свойства нитрозопиридинолов не исследованы.

Целью изобретения является расширение сферы возможного применения химических соединений ряда нитрозопиридинолов общей формулы где R метил, R'-окси;
R метил R'-метил;
и их калиевых солей, а также расширение арсенала иммуномодулирующих средств.

Иммуномодулирующие свойства изучали на мышах линий СВА и С57В1/6 по способности влиять на IgM антителообразование в селезенке in vivo (АОК) и на культуре лимфоцитов доноров in vitro в тестах спонтанной и ФГА стимулированной пролиферации лимфоцитов.

Определение количества АОК к эритроцитам барана (ЭБ) в селезенке мышей (линии СВА и С57В1/6 соответственно высоко- и низкоотвечающие IgM антителообразованием на ЭБ) проводили с препаратом 3-нитрозо-4-метил-5-циано-2,6-пиридиндиолом. Были использованы самцы линии СВА и С57В1/6 6-8-недельного возраста, полученные из питомника "Столбовая". Контрольная и опытная группы составлялись из 10 животных. Нитрозопиридинол вводили мышам С57В1/6 в одной серии одновременно с внутрибрюшинной иммунизацией ЭБ (10⁸ ЭБ на мышь) индуктивная фаза, а в другой серии на 2-е сутки после иммунизации ЭБ продуктивная фаза. Доза вводимого препарата в данной серии была 20 мг/кг массы тела. Контрольным животным вводили физиологический раствор.

Мышам линии СВА нитрозопиридинол вводили в индуктивную и продуктивную фазы в дозе 20 мг/кг массы тела, в дозе 15 мг/кг массы тела в индуктивную фазу и в дозе 10 мг/кг массы тела в продуктивную фазу. Животных забивали на 5-е сутки и определяли количество антителообразующих клеток по числу гемолитических бляшек модифицированным методом локального гемолиза в полужидкой среде. Антителообразующие клетки расчитывали на 10⁶ клеток селезенки.

Результаты исследований представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, однократное внутрибрюшинное введение 3-нитрозо-4-метил-5-циано-2,6-пиридиндиола мышам С57В1/6 и СВА в дозе 20 мг/кг массы тела обнаруживает отчетливое иммунодепрессивное действие на гуморальный иммунный ответ на тимус зависимый антиген эритроциты барана. Супрессорное действие нитрозопиридинола было более сильно выражено при введении препарата в продуктивную фазу иммунного ответа. У мышей С57В1/6 в продуктивную фазу иммунный ответ снижался на 25% а у мышей СВА при аналогичной дозе иммунный ответ на эритроциты барана отменялся полностью, т.е. 3-нитрозо-4-метил-5-циано-2,6-пиридиндиол обладает отчетливым иммуносупрессивным действием.

Спонтанную и ФГА стимулированную пролиферацию лимфоцитов под влиянием нитрозопиридинолов изучали на мононуклеарных клетках (МНК), выделенных из стабилизированной ЭДТА периферической крови здоровых доноров станции переливания крови г. Новосибирска в одноступенчатом градиенте плотности фиколла-верографина (р 1,078 г/см³). Выделенные МНК трижды отмывали с переосаждением в забуференном фосфатами физиологическом растворе с 0,25%-ной желатиной. Исследовали воздействие нитрозопиридинолов на пролиферативную активность МНК в монокультуре и в реакции бластной трансформации в ответ на РНА S (Sоrva) в концентрации 5 мкг/мл.

Нитрозопиридинолы 2,4-диметил-3-нитрозо-5-циано-6-пиридинол и 3-нитрозо-4-метил-5-циано-2,6-пиридиндиол вносили в конечных концентрациях 0,2; 2; 20; 50; 100; 200 мкг/мл. МНК культивировались (10⁶ клеток в мл) в среде РРМ1-1640 (Flow Lab) с добавлением 20%-ной пулированной инактивированной сыворотки людей АВ (IV) группы, 2 ммоль L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина в течение 72 ч в атмосфере 5%-ного СО₂ при 37^оС в 96-луночном полистироловом планшете. За 18 ч до окончания культивирования в тест-систему добавляли ³Н-тимидин (1 мкКи на лунку). После окончания культивирования содержимое лунок с помощью сборника клеток Titertek переносили на фильтры. Пробы просчитывали на β-счетчике Multimat (Intertechnik). Рассчитывался индекс влияния (ИВ), представляющий отношение абсолютных цифр включения изотопа в нуклеопротеидные фракции МНК в присутствии нитрозопиридинолов и без них. Результаты представлены в табл. 2.

Изучение индекса влияния для 3-нитрозо-4-метил-5-циано-2,6-пиридиндиола показало, что иммуносупрессивный эффект нитрозопиридинола проявляется уже при концентрации последнего в инкубационной среде 20 мкг/мл. Спонтанная пролиферация при этом снижается на 44% а РНА-стимулированная на 75% (Р < 0,05). При концентрации 50 мкг/мл спонтанная пролиферация снижалась на 72% (Р < 0,05), а стимулированная РНА на 79% (р < 0,05). Большие концентрации оказывали аналогичный эффект.

Изучение индекса влияния 2,4-диметил-3-нитрозо-5-циано-6-пиридинола выявило наличие иммуносупрессивного эффекта на дозе 2 мкг/мл в стимулированной РНА культуре. С увеличением концентрации нитрозопиридинола в среде инкубации эффект усиливался и начиная с дозы 50 мкг/мл практически полностью угнетал пролиферацию. В спонтанной культуре супрессорный эффект проявлялся с дозы 50 мкг/мл и выше.

Для исключения прямого действия нитрозопиридинолов на РНА была проведена серия исследований с использованием реакции гемагглютинации.

Исследование проводилось следующим образом. В полистрольные планшеты с лунками вносились 2% -ная суспензия эритроцитов (0,1 мл) и РНА в конечной концентрации 5 мкг/мл. В эту тест-систему дуплетами добавляли нитрозопиридинолы в разведениях от 200 до 0,2 мкг/мл. Планшеты инкубировали 120 мин при комнатной температуре и учитывали гемагглютинацию эритроцитов по форме осадка. При наличии агглютинации эритроциты покрывают все дно лунки. Отсутствие агглютинации эритроцитов четко очерченным пятном в самой лунке.

В результате постановки реакции ГА с последовательным разведением нитрозопиридинолов выявлено, что степень ГА в опытных лунках визуально не отличается от степени ГА в контрольных лунках.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать выводы о наличии у нитрозопиридинолов иммуносупрессивного эффекта, что подтверждается их действием на имунный ответ на эритроциты барана в реакции АОК и действием на спонтанную и РНА индуцированную пролиферацию лимфоцитов. Отрицательные результаты, полученные в реакции гемагглютинации с разными концентрациями нитрозопиридинолов указывают на прямое действие изученных соединений на пролиферативную активность лимфоцитов и отсутствие влияния на РНА.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушением системы иммунитета. Целью изобретения является расширение сферы возможного применения химических соединений ряда нитрозопиридолов. Предложенный препарат эффективнее на 70-100% азатиоприна (имурана) по способности влиять на антителообразование в селезенке. Так при внутрибрюшинном 4-кратном введении высокоотвечающим мышам линии СВА (после иммунизации эритроцитами барана) в дозе 30 мг/мг массы азатиоприна количество АОК в селезенке снижалось (недостоверно) на 24% Предложенный иммунодепрессант при однократном введении одновременно с эритроцитами барана в дозе 20 мг/кг массы достоверно снижал количество АОК на 74% в индуктивную фазу и практически полностью отменял иммунный ответ в продуктивную. 2 табл.

Применение производных нитрозопиридинолов общей формулы

где R метил, R′ окси или R метил, R′ метил,
и их калиевых солей в качестве иммунодепрессантов в эксперименте.