Способ маркирования 11-й хромосомы человека,рекомбинантная плазмидная ДНК @ 53 для маркирования,фрагмент геномной ДНК @ 53 для маркирования и способ получения фрагмента ДНК @ 53 Советский патент 1986 года по МПК C12N15/00 

1203108

GAACATTCCTATAGATAGAGCAGGTTGTAAACAATCTTTTTGTAGAATCTGCGATTGGAGATTTGGACTOCTTTCACCCC

TACTGTAGTAAAGGAAATAACTTCATCTAAAAACCAAACGOAAGCATTCACAGACAATTCTTAGTOATAATTOCATTGAT ClAACAGAGCTGAACATTCCTTTAGATGGCGTAGTTTCCAAACACACTTTCTGTAGAATCTGCAAGTGGftTATTTGGACT

TCTCTGAGGATTTCGTTOGAAACGGGATAAACTVcCCAOAACTACACGGAAGCATTOTOAGAAACTTCTTTGTGATGTTT GCATTCAACTCACAGAGTTGAACCT7GCTTTCATAGTTCAGCTTTCAAACACTCTTTTTGTGGAATCTGCAAGTGCATAT

TTOGACCACTTTGIGGCCTTCCTTCGAAACGGGIATATCTTCACATCAAACCTAGACCGAAGCATTCTCAGAATOTTTCC TGTGACGACTGCATTCAACTCACAGAGATGAACAATCCTGCTGATPGAGCAGTTTTGAAACTCTCTTTCTTTOOATTCTO

CAftGTTGATATGTSGACCTCTGTGAAGATTTCGTTOGAAACGGGTTCATCTTCACAGAAAAACTAAACAOAAGCATTCTC AGAAACTGCTITGTGATGTTTGTGTTCCACTTCAAGAATTGAACTTTCCTCTTGACAGAGCAGCTCTOAAACCCTCTTTT

TCTAGAATCTGCAAGTGGACATTrGGAGGGCTTTGfiGGr.CTOTCGTGCAAAAGGAAAATCTTCACATAAAAACTAOATOO AAGCATTCTCAGAAACTACTTTGTGATGATTGCAnCGACTCACAGACTTGAACATTCCTATAOATAGAGCAGOTTOTAA

ACAfiTCTTTTTGTAGAATCIOCGAITGaAGATTTGGACTGCTTTGAOGCCTACTGTAGTAAAOOAAATAACTTCAICTAA AATCCAAACGGAAGCATTCftCAGACAATTCTTAGTGATAATTGCATTGATCTAACAGAGCTGAACATTCCTTTAGATGGC

CTAGTTTCCAAACACACTTTCTCTAGAATCTGCAAOTGGATATTTOGACTTCTCTGAGGATTTCOTTCGAAACCGGATAA ACTTCCCAGAACTACACGGAAGCATTGTGAGAAACTTCTTTGTGATGTTTGCATTCAACTCACACAGTTGAACCTTGCTT

TCATAGTTCAGCTTTCAAACACICTTTTTGTGGAAyCTeCAAGTGGATATTTGGACCACTTTOTOOCCTTCCTTCGAAAC GGGTATATCTTCACATCAAACCTAGACAGAAGCATTCTCAGAATGTTTCCTGTGACGACTGCATTrAACTCACAOAGCTG

AACAACCCrGCTGATGGAGCAGTTTTGAAACTTTCrTTGGATTCTGCAAGTGGATATGTGGACCTCTGTOAAGATTTCGT TGCAAACGGTTTCATCTTCACAGAAAAACTAAACAGGAGCATTCTCAGAAACTGCTTTGTDATGTTTGTGTTCCACTTCA

AGAATTGAACTTTCCTCTTGACACAGCAGCTCrOAAACCCTCTTTTTCTACAftTCTaCAAGTGGACATTTGGAGOGCTTT GAGGCCTG7GGTGGAAAAGGAAAATCTTCACATAAAAACrAGATGGAAGCA7TCTCAGAAACTACTTTGTCATGATTGCA

TTCGACTCACAGAGTTDAACATTCCTATAGATAGAGCAUaTTGTAAACAATGTTTTTGTAGAATCTGCGATTGGAGATTT GGACTGCTTTGAGGCCTACTGTAGTAAAGGAAATAACTTCATCTAAAAACCAAACGGAAGCATTCACAGACAATTCTTAG

TGATCATTGGATTGAACTAACAGAGCTGAACATTCCTTTAGATGGAGAAGTTTCCAAACACACTTTCTOCA

имеюций тандемную,организацию в геноме и кластеризованную локализацию в прицентромерном районе 11-и хромосомы человека и не участвующий в синтезе белка, для специфического маркирования хромосомы человека

А. Способ получения фрагмента ДНК pHS 53, включающий эндонукле- азный-гидролиз геномной ДНК из лимфоцитов человека рестриктазой Pstl, лигирование полученных рестриктных

Изобретение относится к медицш-ic- кой генетикеS в частности к области конструирования молекулярно-генети- ческих маркеров, и может быть использовано для достоверной идентификации индивидуальных хромосом человека в норме и патологии, включая пренатальную диагностику, а также для цитогенетического картирования генома человека.

Изобретение не имеет аналогов, так как предлагаемый способ.маркирования 11-й хромосомы человека разработан впервые.

Целью изобретения является соз-- дание молекулярно-генетического

фрагментов в участке узнавания для рестриктазы Psi: бактериальной плаз- миды pKNool генетическую трансформацию клеток E.coli НВ 101 реком- бинантной ДНК, селекцию рекомбинант- ных клонов, содержащих фрагменты альфоидной ДИК, по результатам гибридизации на колониях и идентификацию маркерного фрагмента путем молекулярной гибридизации на метафазных хромосомах человека в цитологических препаратах in situ.

.маркера 11-й хромосомы человека ,

Суп(ность изобретения заключается в том, что клонированный фрагмент

ДНК рН 53 из лимфоцитов человека, представляющий собой повторяющуюся последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера

11-й хромосомы человека. Данный фрагмент имеет длину 2546.пар нук- леотидов и состоит из 15 альфоидных мономеров (длиной 167-171 н.п.каж- дыГ;), расположенных тендемно, т.е.

по типу 3 -конец предыдущего мономера к 5 -концу последующего мономера. Полный нуклеотидный текст фрагмента pHS 53 следующий:

GAATCTGCAAGTGGATATTTGGACTTClCTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGATAAftCTTCCCAGAACTACACGGA

AGCATTGrOAGAAACTTCrTTGTGATUTTTGCATTCAACTCACAGAGTTOAACCTTfeCTTTCATAGTTCAGCTTTCAAAC ACTCTTTTIGTAGAATCTGCAAGIGGATATTTGGACCACTTTGTGGCCTTCCTTCGAAACnOGTATATCTTCACATCAAA

CCTAGACCGAAGCATTCTCAGAATGTTTCCTTTGATGACTGCATTCAACTCACAGAOOTGAACAATCCTGCTGATGGAGC AGTnTGAAACTCTCTTTCTTTGGATTCTGCAAGTGOATATOrGGACCTCTGTC.AAGATTTCTTTDOAAACGGGTTCATC

TTCACAGAAAAACTAAACAGAAGCArTCTCAGAAACTGCTTTGTGAfGTTIGTGTTCCACTTCAGGAATTAAACTTrcCT CTTGACAGAGCAGCTCTGAAACCCTCTTATTCTAGAAICTGCAAGTGGACATTTGGAGGACTTTGAGGCCTGTfiGTGGAA

AAGGAAAATCTTCACATAAAAACrAGATGGAAGCAnCTCAGAAACTACTTIGTGATGATTGCATTCGACTCACAGAGrT GAACATTCCTATAGATAGAGCAGGTTGTAAACAA TCTTTTTGTAGAATCTGCGATTGGAGATTTGGACTGCTTTGAGGCC

TACIGTAGTAAAOGAAATAACTTCATCTAAAAACCAAACGGAAGCATTCACAGACAATTCTTAGTOATAATIGCAITGAT CIAACAGAGCTGAACATTCCTTTAGATGGCGTAGTTTCCAAACACACTTTCTGTAGAATCTQCAAGTGGATATTTGGACT

TCTCTOAGGATTTCGTTGGAAACGGGATAAACITCCCAGAACTACACOGAAGCATTGTUAGAAACTTCrTTGIQATGTTT GCATTCAACTCACAGAGTTGAACCTTGCTTTCATAGTTCAGCTTTCAAACACTCTTTTTGTGGAATCTGCAAGTGGATAT

TTGGACCACTTTGTGGCCTTCCTTCGAAACGGGIATATCTTCACATCAAACCTAOACCGAAGCATTCTCAGAATCITTCC TGTGACGACTGCATTCAAC TCACAGAGATGAACAATCCTGCTGATGGAGCAGTTTTGAAACTCTCTTTCTTTOQATTCTO

CAAGTTGATAIGTGGACCICTGTGAAGAITTCGTTGGAAACGGGTTCATCTTCACAGAAAAACTAAACAGAAGCATTCTC AGAAACTGCTTTGTGATGTTTGTGTTCCACTTr.AAGAATTGAACTTTCCTCTTGACAGAGCAOCTCTGAAACCCTCTTTT

TCTAGAAICTGCAAGTGGACATTTGGAGGGCTTTGAGGr.CTOTGGTGCAAAAGGAAAATCTrCACATAAAAACTAQATaO

ACAATCTTTTTGTAGAATCrGCGATTGGAGATTTGGACTGCTTTGAGGCCTACTGTAGIAAAGaAAATAACTTCATCTAA

GTAGTTTCCAAACACACTTTCTCTAGAATCTGCAAGTGGATATTTGGACTTCICTGAGGATTTCGTTGGAAACDGGATAA ACTTCCCAGAACTACACGGAAGCATTGTGAGAAACTTCTTTGTGATGTTTGCATTCAACTCACAGAGTTGAACCTTGCTT

TCATAGTTCAGCTTTCAAACACTCTTTnGTGGAATCTGCAAGTGGftTATTTGGACCACTTTOTOQCCTTCCTTCGftAAC GGGTAIATCTTCACATCAAACCTAGACAGAHGCATTCTCAGAATGTTTCCTGTGACOACTGnATTCAACTCACAGAGGTG

AACAACCCTGCTGArGGAGCAGTTTIGAAACTTTCTTTGGATTCTGCAAGTGGATATGTGGACCTCTGTGftAGATTTCGT TGGAAMCGGTTTCATCTICACAGAAAAACTftAACAGGAGCATTCICAGAAACTGCTTTGTGATGTTTGTGTTCCACTTCA

AGAATtGAACTTTCCTCTTGACAGAGCAGCTCTGAAACCCTCTTTTTCTAGAATCTGCAAGTGGACATTTGGACOGCTTT GAGGCCTGTGGTGGAAAAGGAAAATCTTCACATAAAAACTAGATGGAAGCATTCTCAGftftftCTACTTTGTGATGATTCCA

TICGMCTCACAGAGTTGAACArTCCTATAGArAGAGCAOGTTGTAAACAATGTTTTTGTAGAATCTGCGATTGGAGATTT GGACTGCTTTGAGGCCTACTGTAGTAAAGGAAATAACTTCATCTAAAAACCAAACGGAAGCATTCACAGACAATTCTTAG

TGATCATTGGATTGAACTAACAOAGCTGAACATTCCTTTAGATOGAGAAGTTTCCAAACACACTTTCTOCA

Данная последовательность нуклеот дов относится к классу альфоидной ДНК, т.е. обладает гомологией с dL - фракцией сателлитоподобной ДНК африканской зеленой мартышки. Последовательность содержит стоп- кодо во всех направлениях считывания, что прямо свидетельствует о том, что она не кодирует белок.

Источником выделения маркерного фрагмента pHS 53 служит тотальная ДН лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультра- фильтрующей мембране типа ХМ-300 Amicon. Препарат очищенной лимфо- ц тарной ДНК человека (полученной от индивидов мужского пола) обрабатывают рестриктазой Pstl до полного гидролиза. Полученные рестриктные фрагменты вшивают с помощью лиги- рования по липким концам в, Pstl- сайт бактериального плазмидного вектора pKNool (12,5 Т.П.Н.). Данная плазмида несет ген устойчивости к тетрациклину и фрагмент ДНК фаза Ми (ген Kill), обуславливающий лизис чувствительных бактериальных клеток, Сайт Pstl pKNoo1 располагается в ра- ионе этого гена Kill, что определяет нарущение работы данного гена в результате встройки любого фрагмента

ДНК в данный сайт. Таким образом, трансформация лнгазной смесью ичиане- ризованной плазмиды и рестриктных фрагментов ДНК человекаJ чувствительного к Ми-фагу бактериального штамма (например НВЮО автоматически определяет селекцию только рекомбинант- ных трансформантов. Наличие гена устойчивости к Тс в плазмиде позволяет на среде с зтим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом, AaHHbtfi вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу short-gun) при автоматической селекции на среде с тетрациклином (Тс) ,

На следукинем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны обладающие гомологией с оС -ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитро- целлюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (Р) ДНК тотальной фракции ARl-ДНК человека, которая представлена, в основном, альфоидной ДНК. Колонии, ЛНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отби- рают и используют для определения Х11ОМОСОМНОЙ локализации клонированных i них рестриктных фрагментов ДНК

51

ч.е.гюнска непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ, Для этого препараты хромосом го- толя т из делящихся клеток в культуре лимфоцитов человека по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина С фирма Дифко, США) лимфоциты периферической крови культивируют в пенициллино- вых флаконах при в среде Игла с добавлением до 10% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл,, Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М КС1 и инкубируют 10 мин при , Фиксацию проводят метанол- уксусным фиксатором Св соотношении 3. трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37 °С и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления,

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-НС, рН 7,4; 0,1 М MgC 0,05 М дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфа- тов в эквимолярной смеси (по OjOl ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата)5 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл) , 10 мкл тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/ммоль. концентрация 5 мКи/мл 3 10 мкл ДНК-полимеразьг-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при 20°С удельная радиоактивность ;е- ченых препаратов ДНК составляет около 25 X lO импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинант- пой ДНК pHS 53 с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют в течение 30 с в 0,07 H.NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 9б%тном этиловом спирте; препараты радиоак- тивн1,1:х образцов ДНК денатурируют в

0 S 0 5

1086

гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата- 500 и стандартный солевой раствор (2xE:SC), в течение 10 мин при 00°С; гибридизацию проводят при 37°С в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при 37 С, в двух сменах 2 X SSC при комнатной температуре,, в 70 и 96%-ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высуши- вапггя на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты в течение 2 мин тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Ро- мановского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 или 1 125,

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pHS 53 локализован в прицентромерном районе 11-и пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом,

Пример I, Цельную гепарини- зированную кровь от (здорового донора мужского пола) разводят 0,15MNaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфа- том-500 в соотношении 5:1, смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при , Лейкоциты из над- осадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450 g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 мин), Отмытые клетки ресуспендируют в, буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахорозу, 50 мМ НС (рН 8,0), 5 мМ MgClj, 0,2 мМ EDTA с тритоном Х-100 в конечной концентрации 0,5%, Фракцию ядер отмывают трехкратнь м центрифугированием в том же буфере без тритона Х-100 (450 g, 10 мин).

Ядра ресуспендируют в буфере ТЕ :50 MN ТР1ДС ПС1 , рН 8,0; 5 мМ FDTA) из расчета:100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением саркозила до концентрапии 1%,

712

Лизат инкубируют при не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 20000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, сни- ЗУ закрытый ультрафильтром ХМ-300 (Amicon). На супернатант наслаивают равный объем буфера ТЕ + 1 %--ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной каме- ры диализной мембраной..Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру;обе электродные- камеры за- полняют буфером,содержащим 89 мМ f-TTUf НГ,1,89 мМ H,,BOj и 5 мМ EDTA (рН 8,3. Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см в теч ение 6-8ч

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а желеобразный слой ДНК растворяют в нужном объеме О, И ТЕ.

Для вьщеления препаративных количеств плазмидной ДНК культуру E.coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л, NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (ЮО мкг/мл ампицилина, 20 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл хлорамфеникола) при 37°С на качалке в течение ночи. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 мМ ТРИС -НС1 (рН 8,0), 50 Mfl EDTA и 5% тритона Х-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы до- водят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65 С. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при проводят , фенольную, а затем хлороформную де- пр.отеинизацию. ДНК-из раствора осаж- дают равным объемом изопропилового спирта (--18°С, 20 мин), осадок растворяют в ТЕ. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1 х SSC (I X SSC 18 г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при 8l C в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением

5 0 5

0

5

равного объема 1М КС 1+20 мМ ГРис --:- С 7,1 при О С, Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S(Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см объема колонки. Фракции, сожержащие кольцевые формь: плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают 50%-ным изопропиловым или 70%-ныы этиловым спиртом, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере ТЕ до нужной концентрации.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактерршльньгх клонов выделяют из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис- НС1 (рН 8,0); 20 EDTA, 50 М.М глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последую- тей инкубацией в течение 30 мин при 0°С. К пробе добавляют 2 мл раствора 0.2 H.NaOH с 1% SDS и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин, К лизату добавляют i 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на час при О С. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (12000 об/м1м, 20 мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18 С. 30 мин), Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ ТРИ а -НС 1 (р1 8,0) + 0,1 М ацетата натрия н переосаждают зтано- пом, Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл ТЕ.

Эндонуклеазн:; то обработку ДНК человека и бактериальных плазмнд проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ rpHf-HCl (рГ1 7,4), 10 мМ MgCl., Ю мМ NaCi и i мМ дитиотреитола (DTT) , Полный зндоиуклеазный гидролиз ДНК достигают при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при 37°С, Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70 С в течение 10 мин либо добавлением 1/4 объема смеси 0.1%-ного раствора SDS, 25%-ного раствора сахарозы, 5 мМ ацетат натрия и 0,05%-ного раствора бромфенолового синего.

|1ля получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальн по плазмиду

91

pKNool, несуп1ую ген устойчивости к тетрациклину, и последовательность фага Ми, обуславливающую признак убийства, в которой расположен уникальный сайт для рестриктазы Pst. Данное сочетание позволяет проводит одноэтайный отбор рекомбинантных клнов при клонировании фрагмента ДНК человека в Pstl-сайте пЛазмиды.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E.coli НВ101 и выращивают на качалке при до мутности А550 0,4-0,5, Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-. 5 мин, с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде, Осадок промы-- вают равным объемом охлажденного до О С раствора 100 мМ СаС1г клетки осаждают и ресуспендируют 12 мл 100 мМ CaClj. Клеточную суспензию выдерживают на холоду 20-30 мин, центрифугируют 5 а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaClt с 15%-ны глицерином. После инкубации полученной суспензии при О С по крайней мере в течение 30 мин культура го- тона к трансформации. Культуру хранят в малых порциях при -80 С, при этом компетентность сохраняется по крайней мере в течение 4-5 месяцев,

К 200 мкл компетентной культуры бактерий при О С добавляют 0,1- 0,2 мкг лигированной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42 С) на 60-90 с и снова помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 ч при . Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри)и добавками необходимых антибиотиков, обуславливающих селекцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора, содержащего 0,1 0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1.в 0,015М ЛаС1, 5 мМ CaCl и 5 мМ MgCl.,, инкубируют 10 мин при комнатной темпе- ратуре, ДНК-азу-1 инактивируют при 70 С, 10 мин,, после чего к раствору добавляют буфергаш раствор 0,4 М

810

Трис-НС (рН 7,4)., 50 MgCl, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема , по 1 н молю ка;едого из не меченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из d. - Р-дезоксинуклеозидтрифос- фатов с удельной активностью ПО ТВ (ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед,ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение часа при . Радиоактивность кислото- нерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике L KB 215 по специальной nporpaMivie, Средняя удельная активность меченых препаратов составляет 2-5 X 10 имп/мин/мкг ДНК.

Для идентификации вставок ДНК человека в состаЕ.е гибриднь х клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как ре- комбинантные5 репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (millipore, НАОТ ), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашкаХ Петри, и пырагцивают их в течение суток при 37°С, Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхност}. раст.яора О,, 5 К NaOl и оставляют на 5-10 мик: Подсушив фильтр с нижней стороны 4 :1льтро- вальной бумагой, его дважды по Юмин обрабатывают раствором м (рН 7,5), а затем 1,5 М МаСi с 1 М ГРЯС ЫС1 (рН 7,5), Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2 X SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при 37°С. Далее подсу1пенн|,1Й фильтр промывают в 0,3 М NaCl,,a. затем сушат под вакуумом при 12 ч.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при в растворе 2 х SSC, 0,5,.; SDS, 0,1% фикол-400 и-0,1% поли- вннилпирролидон-350 втечение 60- 90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промакивают фильтровальной бумагой и помещают в 4-5 мл гибридизадионной смеси, содержащей 6 х SSC, 0,1% SDS, 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли (А) и денатурированнуга пробу Л р-меченой ДНК с суммарной активностью. 1-5 X 10®имп/мин. Гибридизаию проводят при в течение 18- 24 с. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5 х SSC с 0,5/„ SDS ри 68°С в течение нескольких часов. тмытые фильтры окончательно высушиII

вают н помещают н кассету с рел1тге- новской пленкой РМ-1. Через 2-24 ч экспозипии проявляют радиоавтографи чески и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой Pstl фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на .фильтрах беретс проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после злектрофоретического раз деления гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой EcoRl и идентификации полосы AR1 (340 н.п.). В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным методом замеще- кия. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на двух колониях, одн из которых получила название pHS 53, соответственно ее порядковому номеру в исходной клонотеке.

; Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови стимулированных к делению с помощью фитогемаглютинина /(фирма Дифко, США.) в пенициллиновых флаконах при в среде Игла с добавлением до 10% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За час до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресус- пендируют в гипотоническом растворе 0,07 М КС1 и инкубируют в течение 10 мин при . Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:) трижды по 20 мин. Пре

параты хромосом хранят при 37 С и используют в опытах не позднее 2- 3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят-изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М Tfv c-HCl, рЫ 7,4; 0,1 М 0,05 М дитио- .треитол , 5 мкл нерадиоактивных дез- оксинуклеозидтрифосфатов в эквимо- лярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением тимидинтрифосфата),

j

10 t5 20 5

5

5

O 5

108. 12

5 кл ЛПК-азы-1 (когпг.ентрация :кг/мл) , 10 мкл Н-тимиринтрифос- й-ата (удельная активность 114 Ки/ммоль, концентрация 5 ) , 1 О мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеср составляет 150 мкл. Реакцию ведут в течение 20-40 мин при 20 С. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25 X 10 импульсов в минуту в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинант- ной ДНК pHS 53 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 н NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96%-ном этиловом спирте. Препараты редиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибри- дизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор

(2 X SSC), в течение 10 мин при 100 С. Гибридизацию проводят при 37 С в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 х SSC при 37 С, в двух сменах 2 х SSC при комнатной температуре, в 70 и 96%-ном этиловом

.спирте по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартных амидо- лов1,м проявителем в течение 2 мин

препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-нь м раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (рН 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 или 1125.

Гибридизация in situ на метафаз- ных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pHS 53 локализуется только в прицентромерном районе 1I-пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.

П р и М е р 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 11-й хромосомы в тех случаях, когда :зта хромосома (один из

131

Г омологов данной пары затрюнута пе- ре(.;тройкой, т.е. имеет потерю како- 1 О--либо участка или, напротив, добавку хромосомного материала, что будет сказываться на размере 11-й хромосомы и ее форме.

Все процедуры по выделению образца ДНК pHS 53 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а так же Бсе процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1 , Отличие состоит только в тоМ; что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используются препараты хромосомного набора жешдивы, являющейся носителем сбалансированной транслокации (переноса), терминальной трети короткого пле.ча I -и хромосомы на конец длинного плеча 8-й хромосомы, В результате такой транслокации короткое плечо хромосомы значительно укорочено и при обычном визуальном осмотре метафазно пластиннике данной перестройкой под микроскопом диагностика указанного шрушения требует высокого уровня дитогенетического анализа. Однако с помощью молекулярного маркера pHS 53 для 11-й хромосомы гомологичный партнер с укороченным коротким плечом в этой паре легко распознается непосредственно под микроскопом.

П р и м е р 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера pHS 53 для 11-й хромосомы является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделяшихся) ядер, Как известно, хромосоь1ы чело- века анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением является половая-Х-хромосома, наличие ко- торой в норме у женщин можно установить по наличию в интерфазном ядре компактного тельца полового хроматина, образованного одной из двух Х-хромосом в женском наборе. Однако с помощью молекулярного маркера pHS 53, специфически маркиртещего только 11-ю хромосому человека, на

с

д о 5

0 5 0 5

0

П814

личие этой хромосомы в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, а только по анализу изображений интерфазтплх ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК pHS 53 гибри- дизлруется с ДНК прииентромерного района 1 1-й хромосомы и в том случае когда эта хромосома нахо/дится в расплетенном состоянии на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть / после гибридизации и приготовления радиоавтографов) два практически одинаковых по раз меру скопления зерен серебра (сигналов изотопной метки/, если гомологичи1;1е партнеры 11-й пары расположены в неделятемся ядре на достаточном расстоянии, или одно крупное скоплеь ие зерен метки, если оба партнера расположены поблизости.

Все процедуры по выделению образца ДНК pHS 53 к его обработки с изо- .топной меткой для гибридизации на иктерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов .клеток из культуры лимфоцитов периферической крови повторяются аналогично таким же процедурам, описанным в примерах 1 и 2. В каждом интерфазном ядре обнаруживаются два крупнь х скопления гранул метки, соответствующих двум гомологичным хромосомам П-и пары. В разных ядрах расстояния меж ду этими скоплениями различны. Таким образом, появляется реальная возможность впервые непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретной пары хромосом в клетках человека, что представляет большой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека,

Таким образом, клонированная последовательность ДНК pHS 53 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 11-й хромосомы человека как в стандартшях препаратах нормальных хромосомных iia6opOB или в случаях с перестройками хромосомы, так и в препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике - медико-генетического консультирования, включая пренатальную диагностику случаев с перестройками 11-й хромосомы человека. Возможно эффек151203)0816

тивное применение предлагаемого спо- используемых для цитогенетического соба 13 анализе гибридных клеточ- картирования нормальных и мутантных ных линий (человек-грызун)- , широко генов человека.

1. Способ маркирования 11-й хромосомы человека, включаюй ий приготовление препаратов метафазных хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови человека, денатурацию хромосомной ДНК, радиоактивное мечение рекомбинатной ДНК pHS 53 OAATCTGCAAGTGGATATTTGGACTTCICTGAGGATTTCGTTGGAAACGGGATflAACTTCCCAGAACTACACGGA AGCATTGTGACAAACTTCTTTGTGATijTTTGCATTCftACTCACAGAGTTOAACCTTGCTTTCATAGTTCAGCTTTCAAAC ACTCTTTTTGTAGAATCTGCAAGTGGATATTTOGACCACTTTGTGGCCTTCCTTCGAAACGfjQTATATCTTCACATCAAA CCTAGACCGAAGCATTCTCAGAATGTTTCCTTTGATGACTGCATTCAACTCACAGAGGTOAACAATCCTGCTGATGGAOC AOTTTTGAAACTCTCTTTCTTTGGftTTCTGCAAGTGGATATOTGGACCTCTGTGAAGATTTCTTTOGAAACGGGTTCATC TTCACAGAAAAACTAAACAGAAOCATTCTCAGAAACTGCTTTGTGAfGTTTGTGTTCCACTTCAGDAATTAAACTTTCCT CTTGACAGAGCAGCTCTGAAACCCTC9TATTCTAGAATCTGCAAGTGGArATTTGGAGGACTTTGAGGCCTGTr,GTGGAA AAGGAAAATCTTCACATAAAAACTAGAIGGAAGCATTCTCAGAAACTACTTTGTOAIGATTGCATTCGACTCACAGAGTT тритием путем реакции нуклеотидно- го замещения, денатурацию меченой рекомбинатной ДНК, молекулярную гибридизацию меченой ДНК с ДНК мета- фазных хромосом, промывку препаратов, радиоавтографическое проявление меченого гибридизованного фрагмента на хромосомах с последующим их ок рашиванием. 2. Рекомбииантная плазмидная ДНК pHS 53 для специфического маркирования прицентромерного района 11-й хромосомы человека, резмером 12500 пар нуклеотидов, состоящая из: большого Pstl-фрагмента векторной плазмиды pKNool размером 10000 пар нуклеот1адов, несущего ген устойчивости к тетрациклину, которьм представляет собой часть бактериальной плазь5иды Со Е i и ограничен участками расщепления рестриктазами EcoRl и Ира 1, и последовательность ДНК фага Ми, обуславливающую лизис чувствительных клеток, ограниченную дву- ця участками расщепления рестрикта- зой EcoRl; Pstl-фрагмента геномной ДНК из лимфоцитов человека, 3. Фрагмент геномной ДНК pHS 53 из лимфоцитов человека, включающий повторяющуюся последовательность альфоидной ДНК, длиной 2546 пар нуклеотидов с последовательностью (Л ro о 00 00