Способ определения нарушения иммунного статуса Советский патент 1986 года по МПК A61K39/00 G01N33/541 

. «

I ,

Изобретение относится к медицине конкретнее к терапии, и может быть использовано для определения нарушения иммунного статуса, назначения адекватного лечения и контроля за проводимым лечением.

Цель изобретения - повышение точности способа путем выявления с помощью двойных антител одновременно IgG, IgA и IgM.

Способ осуществляется следующим образом.

№-1мунорадиометрическим методом двойных антител в составе комплексов выявляются иммуноглобулины трех классов - А,. М и G При этом фиксированный на твердой фазе компонент комплемента взаимодействует с иммунными комплексами с последующим дбавлением антител 1-го порядка с ак тивностью к иммуноглобулинам классов А, М и G и меченных; изотопом I антител 2-го порядка. Наличие иммунных комплексов определяется на основе подсчета процента связавшихся ме ченых антител 2-го порядка при использовании антител 1-го порядка к каждому тчлассу иммуноглобулинов - А М, G. В случае содержания одного из классов иммуноглобулинов по сравне- нию с нормой определяют нарушение иммунного статуса.

Пример 1. Больная К., 19 лёт. Диагноз: ревматоидный артрит, серопозитивный вариант, активность П (ревматоидный миокардит). В течение месяца получала метиндол дозе до 150 мг/сут в сочетании с плаквенилом. Несмотря на проводимую терапию продолжала предъявлять жалобы на утреннюю скованность до 2 ч, выраженные боли в суставах. Для дальнейшего лечения появилась необходимость в проведении определения

нарушения иммунного статуса.

Способ определения нарушения иммунного статуса проводится в два этапа.

1 этап. Необходимые реактивы и и получение,

1)забор, приготовление и хранен пробы осуществляется на основе реко мендаций ВОЗ (3 ) ;

2)получение Clq фракции комплемента из донорской сыворотки;

3)набор кроличьих антисывороток к.иммуноглобулинам классов А, М, и G человека (производство НИ11 вакцин

5 0 5 Q

5

5

0

152

и сывороток, г. Горький - антитела 1-го порядка;

4) получение меченых ослиных антител к иммуноглобулинам класса кролика - антитела 2-го порядка: используется ослиная антисыворотка к иммуноглобулинам кролика (производство НИИЭ им. Гамалеи), введение изотопа производится с помощью хлорамина;

5). забуферный физиологический раствор - ЗФР (рН 7,4);

6)желатин медицинский;

7)этилен диамин тетрауксусная кислота. - ЭДТА (0,01 М);

8)полистиренойые пробирки;

9)твин 20;

10)счетчик --излучений.

II этап. Определение циркулирующих И1чмунных комплексов.

1) разводят 01q фракцию комплемента до концентрации 0,01 г/л в ЗФР;

2-) полученный раствор разливают по 1,0 мл в 12 полистиреновых пробирок, инкубация при 4 С 72 ч.

3)пробирки промывают 3 .раза с помощью ЗФР;

4)пробирки заполняют 0,01%-ным раствор.ом желатина в ЗФР, инкубируют при +20°С 2ч;

5)смешивают 0,1 мл пробы и 0,2 мл ЭДТА и инкубируют в термостате при 37°С 30 мин;

6)вьшивают из пробирок желатин (см. п. 2), и промывают ЗФР 3 раза;

7)в пробирки N 1-6 вводят по 0,05 мл разведенной пробы (см. п.5) и 0,95 МЛ 0,05%-ного раствора твин 20 в ЗФР, Б пробирки № 7 - 12 - по

i .0 мл 0,05%-ного раствора твин 20 в ЗФР, инкубируют при 37 с I ч;

8)пробирки промыв.ают 3 раза ЗФР;

9)в пробирки вносят по 1,0 мл антител 1-го порядка к 3 классам иммуноглобулинов А, М и G разведенных 1:10 н ЗФР, по приведенной в табл.1 3 дубликатах .

Таблице I

312372

Продолжение табл.1

0,1

0,1

0,1

0,1

10)инкубируют при 1 ч;

11)по 1,0 мл антител 2-го порядка разведенных 1:10000 в ЗФР, вносят в

чистые пробирки № 13 и 14;

12)пробирки № 1-12 промывают 3 раза с помощью ЗФР, пробирки

№ 13-14 закрывают притертой крышкой;

13)подсчитывают активность пробирок на счетчике у-излучений;

14)результаты определяют по формулам:

в - Во . Т

100

при использовании антител 1-го поряд- . ка к иммуноглобулину класса А;

В - В

100

при использовании антител 1-го порядка к иммунноглобулину класса М;

юо

при использовании антител 1-го порядка к иммуноглобулину класса G,

где В , В и В - количество импульсов в минуту в пробирках с пробой (среднее значение дубликатов при использовании антител порядка соответственно к иммуноглобулинам клас сов А, М и G;

в:, в

в

jg, IV Q, - количество импульсов в минуту в пробирках без пробы с одним ЗФР (среднее значение дубликатов при использовании антител I- го порядка соответственно к иммуноглобулинам классов А, М и G )

Т - количество импульсов в минуту в пробирках с добавленными антителами 2-го порядка без последующего

154

промывания (среднее значение тов, пробирки № 13 и 14 , т.е. общий счет добавляемых антител 2-го порядка.

Результаты исследования иммунных комплексов у больной К приведены в табл,2.

Таблица2

10

fS

20

30

35

0

5

0

5

Результаты подсчета процента связывания антител показали: 0,5% при использовании антител 2-го порядка к иммуноглобулинам класса А: 5,60% при использовании антител 2-го порядка к иммуноглобулинам класса М и 0,8% при использовании антител 2-го порядка к иммуноглобулинам класса G.

Полученные результаты указывали на превышение нормы по иммуноглобулину класса М, что свидетельствовало о нарушении иммунного статуса у больной К, т.е. о развитии системных проявлений, в частности о наличии ; ревматоидного миокардита. Необходимо применение глюкокортикоидов.

Больной назначали преднизолон в дозе 20 мг/сут. На фоне терапии наблюдалась положительная динамика суставного синдрома. Результаты исследования .через 1 месяц А 0,5%,

512

М 1,0%, 0,5% позволили начать сни- жение дозы преднизолонй. Отмена проводилась по 2,5 мг в неделю, полностью преднизолон отменили через 2 месяца. Состояние при выпуске удовлетворительное. Результаты контрольного исследования А 0,5%; М 0,5%: G 0,5% свидетельствовали о нормализации иммунного статуса.

Данный пример показателен в нето- дическом плане. В составе иммунных комплексов у больной К в наличии преимущественно иммуноглобулин класса М и при использовании известного способа определения был бы получен лож- ноотрицательный результат, так как им иммуноглобулин G в норме.

Пример 2. Больной Д., 39 лет. Диагно з: инфекционно-аллергичес- кая бронхиальная астма, тяжелое течение, гормональная зависимость, астматический статус. В течение 2 недель лечения глюкокортикоидами - внутривенно калельно гидрокортизон по 250 мг/сут и перорально преднизолон по 25 мг/сут малоэффективно. Состояние больного продолжало оставаться тяжелым. Выявление иммунных комплексов дало следующие резуль- таты. А 1,0%, М 1,0%, G 2,0%. Это указало на наличие выраженного нарушения иммунного статуса - аутоиммунный вариант бронхиальной астмы. В план лечения включили циклофосфан 100 мг/сут. После 3 недель лечения наметился положительньй клинический

Составитель П.Бонардев Редактор Л.Пчелинская Техред В.Кадар КорректорМ.ГОароши

Заказ 3220/7Тираж 660Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,, д. 4/5

.Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

5

0 0

5

.156

эффект, позволивший начать снижение преднизолона. Контрольное исследование : А 0,5%; М 0,5%; G 1,5%.

П р и М е р 3. Больная Р., 26 лет. Диагноз: системная крйсная волчанка, люпуснефрит, хроническое течение, активность П. При поступлении получала преднизолон 25 мг в сутки. Выявление иммунных кo mлeк- сов: А 07,, М 0,3%, G 1,5%. Результаты указывают на незначительное превьш1ение нормы по иммуноглобулину класса G , что в сочетании с нормальным уровнем других классов свидетельствовало о низкой напряженности аутош- мунного процесса и служило показанием к снижению дозы преднизолона. В течение 2 месяцев доза была снкгжена до 10 мг в сутки, Контрольное исследование: А 0%; М 0,3%, G I,0 нормализация иммунного статуса .

В случае использования известного способа у данной больной была затруднена иЕнтерпретация результатов только по :иммуноглобулину класса G, так как нельзя исключить наличие иммун-- ных ко1чплексов с классами А и М. Только на основании имеющихся данных по трем классам можно полагать не- значителышй характер имеющихся нарушений иммунного статуса.

Предложсенный способ позволяет выявить в составе иммунных комплексов три класса нммз оглобулинов - А, М и G и с высокой точностью определить .нарушение иммунного статуса.