Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител к гликопротеиду Е1 вируса восточного энцефаломиелита лошадей Советский патент 1991 года по МПК C12N5/18 

Изобретение относится к вирусологии и гибридомной технологии и может быть использовано в диагностических целях.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, секретирующих монокпональные антитела (МонАТ) с высокой аффинностью, специфичные к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ), с помощью которых можно типировать вирус ВсЭл среди альфавирусов и Флавивирусов.

Штамм получают следующим образом.

Проводят слияние миеломных клеток мышиной природы P3/NS-1-Ag4(NS-1) с

клетками селезенки мышей BALB/c, иммунизированных вирусом ВсЭЛ. Иммунизацию проводят по следующей схеме, i Мышей заражают 10 БОЕ вируса ВсЭЛ внутрибрюшинно. Выжившим мышам на 14-й и 28-й день вводят по 20 мкг очищенного вируса ВсЭЛ в полном адъю- ванте Фрейнда. На 42-й день внутривенно вводят 10 мкг вируса. На 4-й день после внутривенного введения вируса мышей забивают с помощью хлороформа и в стерильных условиях извлекают селезенки, из которых готовят клеточную суспензию.

Ф

оъ

00

оо

Для слияния используют 1 ,7-10 сеезеночных клеток и 4,5x10 клеток иеломы NS-1. Смесь клеток центрифуируют, суперпатянт тщательно удаляют ,- к клеточному осадку добавляют 00 мкл 50%-ного полиэтиленглтшля мол. массой 1000 (ПЭГ 1000) в среде НЕМ. Смесь центрисЬугиругот 4,5 мин ри 600 g. Через 8 мин после добавле- ю ия ПЭГ в пробирку медленно добавляют мл среды ДМГМ и осторожно перемешиают. После этого добавляют еще 10 мл реды ДМЕМ и центрифугируют 5 мин. леточный осадок ресуспендируют в ере-5 е ДНЕМ с 10 М гшюксантина, 4x10 М глицина и 10

имидина, 4xiu М глицина и 1U М миноптерина (селективная среда ГАТГ).

Гибридому 7В6 отбирают по принципу екреции в культуральную среду иммуно 20 лобулинов, специфически связывающихя с вирусом ВсЭЛ. Отбор проводят методом твердофазного радиоиммунного анализа (TPIIA) . Отобранную гибридому дважды субклонируют методом предель- 25 ных разведений, переводят в массовую культуру, подвергают криоконсервации и изучают основные свойства.

Таким образом, штамм гибридной клеточной линии 786 представляет собой 30 трижды клонированную клеточную культуру, секретирующую МонАТ к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей.

Штамм гибридных клеток 7В6 хранится под номером BCKK(fl) 410D и харак- теризуется следующими признаками.

Культуральные свойства.

Среда культивирования - среда Игла MEM в модификации Дульбекко (ДМЕМ), содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, (Ьолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л-Ј а также 5- 2-меркаптоэтанола и HEPES с 15% сыворотки плода коровы и 40 мкг/мл сульфата тентами- Д5 цина. Гибридома 7В6 представляет собой монослойно-суспензионную культуру, в которой только часть клеток (приблизительно 80%) лрикрепляется к поверхности культуральной посуды. Посевная доза 2x10 кл/мл. Частота пассирования - через 3-4 сут. Оптимальные условия для роста гибридомы 7В6 при культивировании при

ток гиб асцита.

Морф

Куль лых кле размера ломой N эксцент часть ц

Крио

Гибр пассаже В каждо хЮ кл да ДМЕМ и 10% д мость к с сохра специфи музейно риальна

Свой штаммом

Гибр глобули ние кла линов п альной использ различн глобули установ чески р вируса ческих 1:20000 ридомой исключи казано

Пр вирусу ток лин

35

40

50

создаются

37°С в атмосфере 5% СО/. Клетки с по- -t клеток

J- in верхности снимаются энергичным встря-|и

хиванием.

Введение в брюшную полость прис- тан-обработанных мышей BALB/c 10 клеВ к 250 мл сыворо 6x10 руют п щенные встрях центриф точный среды Д ок кл шам BAL билизир ем 0,5

,- ю 5

20 25

30

Д516884

ток гибрндомы 7В6 индуцирует ратвнтир асцита.

Морфологические причнтки.

Культура состоит из крупных округлых клетдк, сходных по морсЬологии и размерам с исходной родительской мие- ломой NS-1. Овальное ядро расположено эксцентрично и занимает значительную часть цитоплазмы.

Криоконсервация клеток.

Гибридома 7В6 заморожена на пятом пассаже. Общее количество ампул 20. В каждой ампуле содержится 5 - 10х хЮ клеток. Криозащитная среда - среда ДМЕМ с.40% сыворотки плода коровы и 10% диметилсульфоксида. Выживаемость клеток при разморозке - до 80% с сохранением способности секреции специфических антител. При проверке музейной закладки грибковая и бактериальная контаминация не обнаружена.

Свойства МонАТ, секретируемых штаммом гибридной клеточной линии 7В6.

Гибридома 7В6 секретирует иммуноглобулины субкласса IgG 1 . Определение класса и субкласса иммуноглобулинов проводят методом двойной радиальной иммунодисЬфузии по Оухтерлони с использованием антисывороток против различных субклассов мышиных иммуноглобулинов . Методом иммуноблотинга установлено, что МонАТ 7В6 специфически реагируют с гликопротеидом Е1 вируса АсЭЛ. Титры МонАТ в асцити- ческих жидкостях составляют 1:100000- 1:200000. МонАТ, синтезируемые гиб- ридомой 7В6, являются специфичными исключительно к вирусу ВсЭЛ, что показано в ТРИА.

Пример 1. Получение МонАТ к вирусу ВсЭЛ путем культивирования клеток линии 7В6 in vivo.

35

40

клеток

in |и

В культуральный сосуд емкостью 250 мл вносят 30 мл среды ДМЕМ с 15% сыворотки плода коровы, содержащей 6x10 клеток гибридомы 7В6, и инкубируют при 37 С в течение 3 сут. Выращенные клетки снимают энергичным встряхиванием. Клеточную суспензию центрифугируют 5 мин при 600 g. Клеточный осадок суспендируют в 3 - 5 мл среды ДМЕМ и определяют концентрацию ок с помощью камеры Горяева. клеток вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c, за неделю до тог9 сенсибилизированных внутрибрюшным введением 0,5 мл пристана. Через 10 12 днем у мышеи развивается лепит. От одной мыши можно потучить 3-5 асцнтмческой жидкости, содержащей

у различных альфа- и Лланшшруг.м1. млМонАТ, синтезируемые гибридомои ГВЬ

распознают детерминанту, присущую

МонАТ с титром 1:243000, и клетки гиб-5 исключительно вирусу ВсЭЛ. Выполнемридомы 7В6 в концентрации 5 - 2)х хЮ кл/мл. Клетки можно использовать для введения следующей партии животных. Асцитическую жидкость, как препарат, содержащий МонАТ, расфасовьша- ют и хранят при -20°С. Прививаемость клеток гибридом) 7В6 составляет 100%.

П р и м е р 2. Изучение специфичности МонАТ, секретируемых штаммом гибридной клеточной линии 7В6.

Специфичность МонАТ 7В6 устанавливают методом ТРИА с использованием панели из четырех вирусных антигенов.

ные контроли подтверждают адекватность выбранной панели вирусных антигенов .

Пример 3. Определение вирусЮ ного белка, специфически реагирующего с МонАТ, синтезируемыми гнбридо- мой 7В6.

Вирусный белок - мишень для МонАТ 7В6 определяют методом иммуноблотнн15 га. Белки вируса ВсЭЛ, разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле, переносят из геля на нитроцеллюлоз ную мембрану. Перенос проводят в. течение 4 ч при напряжении 25 В в

15 га. Белки вируса ВсЭЛ, разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле, переносят из геля на нитроцеллюлоз ную мембрану. Перенос проводят в. течение 4 ч при напряжении 25 В в

Панель включает в себя следующие вирусы: вирус восточного энцефаломиели- 20 0,025 М трис-HCl буфере (рН 8,3), со- та лошадей (южный вариант); вирус держащем 0,192 М глицина. Контроль венесуэльского энцефаломиелита лошадей, штамм ТС-83; вирус клещевого энцефаломиелита, штамм 205; вирус эктропереноса белков на нитроцеллюлозу осуществляют прокрашиванием одной полоски мембраны амидочсрным 10 В. Ос25 тальные полоски помещают в -10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,2), содержащий 1% БСА и 0,14 М NaCl, на 16 ч при 4°С Обработанные таким образом полоски инкубируют в течение часа при 37 С с препаратами МонАТ в разведении 1:100. От избытка антител освобождаются трехкратным промыванием мембран ЗФР-твин. Далее мембраны обрабатывают кроличьей антисывороткой к мышиным IgG в разведении 1:500 в течение 1 ч при 37°С. После промывки полоски мембран помещают в раствор белка А, конъ- югированного с пероксидазой хрена (0,2 ME/мл в 1% БСА на ЗФР), и выдерживают в течение ночи при 4°С. Далее полоски промывают и помещают в раствор субстрата, содержащего 0,25 мг/мл о-диадинизина в 10 мМ трис-HCl буфере рН 7,2 и 0,01% перекиси водорода.

мелии, штамм К-1.

По 400 нг каждого вируса фиксируют при помощи этанола в лунках 96-лу- ночных микроплат. Для проведения ТРИА используют МонАТ 7В6, иммунную сыворотку мыши против вируса ВсЭЛ, МонАТ, ЗЕ11, Е6В, 7Е2. Все разведения готовят на 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) на физрастворе, забуференном ЮмМ трис-HCl (рН 7,2) и содержащем 0,01% твин-20 (ЗФР- твин). В лунки с фиксированным антигеном вносят по 50 мкл различных разведений МонАТ, в качестве контроля используют лунки с нанесенным БСА. Далее платы инкубируют в течение 1 ч

при 37 С и трижды отмывают ЗФР-твин. Затем в лунки вносят по 50 мкл кроличьей антисыворотки против мышиных иммуноглобулинов в разведении 1:500 и инкубируют 1 ч при 37°С. Плату

трижды отмывают ЗФР-твин и добавляют

Qjz меченый I - белок А в количестве

2x10 расп/мин (50 мкл) и выдерживают в течение ночи при 4°С. После трехкратной промывки ЗФР-твин диссоциируют меченые иммунные комплексы 2М раствором КОН, переносят содержимое каждой лунки в счетные пробирки и определяют радиоактивность проб с помощью гамма-счетчика. Полученные результаты представлены в таблице.

Анализ данных показывает, что имеется ряд общих антигенных детерминант

1671688

у различных альфа- и Лланшшруг.м1. млМонАТ, синтезируемые гибридомои ГВЬ

распознают детерминанту, присущую

исключительно вирусу ВсЭЛ. Выполнемные контроли подтверждают адекватность выбранной панели вирусных антигенов .

Пример 3. Определение вирусного белка, специфически реагирующего с МонАТ, синтезируемыми гнбридо- мой 7В6.

Вирусный белок - мишень для МонАТ 7В6 определяют методом иммуноблотннга. Белки вируса ВсЭЛ, разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле, переносят из геля на нитроцеллюлоз ную мембрану. Перенос проводят в. течение 4 ч при напряжении 25 В в

0,025 М трис-HCl буфере (рН 8,3), со- держащем 0,192 М глицина. Контроль

0,025 М трис-HCl буфере (рН 8,3), со- держащем 0,192 М глицина. Контроль

переноса белков на нитроцеллюлозу осуществляют прокрашиванием одной полоски мембраны амидочсрным 10 В. Остальные полоски помещают в -10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,2), содержащий 1% БСА и 0,14 М NaCl, на 16 ч при 4°С. Обработанные таким образом полоски инкубируют в течение часа при 37 С с препаратами МонАТ в разведении 1:100. От избытка антител освобождаются трехкратным промыванием мембран ЗФР-твин. Далее мембраны обрабатывают кроличьей антисывороткой к мышиным IgG в разведении 1:500 в течение 1 ч при 37°С. После промывки полоски мембран помещают в раствор белка А, конъ- югированного с пероксидазой хрена (0,2 ME/мл в 1% БСА на ЗФР), и выдерживают в течение ночи при 4°С. Далее полоски промывают и помещают в раствор субстрата, содержащего 0,25 мг/мл о-диадинизина в 10 мМ трис-HCl буфере рН 7,2 и 0,01% перекиси водорода.

В местах образования иммунных комплексов МонАТ и вирусного белка наблюдают появление буро-коричневых полос. МонАТ 7В6 специфически реагируют с гли- копротеидом Е1 вируса ВсЭЛ.

Таким образом, полученный на основе мышиной миеломы штамм гибридной клеточной линии 7В6 продуцирует высо-. коаффинные МонАТ, специфически взаимодействующие с вирусом восточного энцефаломиелита лошадей. С их помощью можно типировать вирус ВсЭЛ среди альфа- и флавивирусов. Гибридома 7В6 обеспечивает получение мышиных иммуноглобулинов субкласса IgC- 1 с титрами 1:100000-1:200000 в количестве 3 - 5 мл асцитической жидкости на привитую мышь. Антитела специфически pea- гируют с гликопротеидом Е1 вируса ВсЭЛ и не реагируют с другими исследо ванными тог авирусами.

16

R

Фор

мула изобретения Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (II)-AIOD - продуцент мококло- нальных антител к гликопротеиду Е1 вируса восточного энцефаломиелита лошадей.

Изобретение относится к вирусологии и гибридомной технологии и может быть использовано в диагностических целях. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток, секретирующих моноклональные антитела (МонАТ) с высокой аффинностью, специфичные к вирусу восточного энцефаломиелита лошадей (ВсЭЛ), с помощью которых можно типировать вирус ВсЭЛ среди альфавирусов и флавивирусов. Штамм гибридных мышиных перевиваемых клеток ВНИИ МБ - 197, 7В6 получают слиянием клеток мышиной миеломы Р3/NSI - AG 4 с клетками селезенки сингенного животного, иммунизированного вирусом ВсЭЛ, южный вариант. Гибридома 7В6 секретирует моноклональные антитела, IGG1, специфически взаимодействующие с гликопротеидом Е1. Штамм гибридных клеток растет в виде стационарной суспензии и вызывает асцитную опухоль у мышей BALB/C. Продуктивность в асцитной жидкости 1:100000 - 1:200000. Штамм хранится под номером ВСКК N 410 Д. 1 табл.

Примеч ание,

МонАТ 7В6 - моноклональные антитела, синтезируемые гибридомой 7В6, асцит.

Иммунная сыворотка против вируса ВсЭЛ - сыворотка мыши, иммунизированной 3 раза по 20 мкг о.чищенного вируса ВсЭЛ. МонАТ ЗЕ11 - моноклональные антитела, синтезируемые гибридомой ЗЕ11, полученной к вирусу ВЭЛ. МонАТ ЕбВ - к вирусу клещевого энцефалита. МонАТ 7Е2 - к вирусу эктромелии.