Способ исследования биологических объектов Советский патент 1986 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к спосоРам для проведения оптического анализа фотосистем (ФС) фотосинтезнрующих оСЗъектов и может быть использовано в области биологических научпр к не- следований,, а также в области сельского хозяйства.

Цель изобретения - сокращение трудоемкости, повьшение точности и информатив.иости.

Известно, что в фотосинтезирующих растительных клетках в красной области спектр.а ответств.енным за ttmyopec- денцию является молекула хлорофила . а фотосистемы II. При этом, квантовый выход (1шуоресценции коррелирует с функциональной активностью фотосинтетического аппарата. Однако в нормальных условиях хлорофил ФС-1 флуоресцирует незначительно, и ис- , .пользование флуоресден1щи в аналити- че.ских делях почти невоз.можно. При ,И11активадии последнего квантовый выход флуоре.сцснлдии хлорофила. увеличивается. Это объясняется тем,, что, в клетке. во.збузвденнаямолекул.аклоро- 6)И.Г1Я э4 ф2ктивно использует энергию на фотосинтез, а при инактивации - н. флуоресдендию. При этом квантовый вы ход флуоресценции, хлорофила а уве- :п чивается не только у фотосистемы II, и.о и у фотосистемы I. .

Разработан способ для получения дискре.тной инф.орм.адии от ФС-1 и .ФС-1 Благодаря селективной инактивации ФС-1 и ФС-11 высокой культурой и од- ирвр.еменному возбуждению и .регистрац из;флуоресценции, получены термограм i-ai флуоресценции. Расшифрованы н.ики, соответствующие ФС-1 и ФС-11. Найдены .способы проведения анализа с помощью этих пиков, в частности, для опреде.ления относительного содержания фотосистем, функтщомальной ак- тивности. хлоропластов и определения генетической устойчивости растений к экстремальным воздействиям.

На .ф.иг.. 1 и 2 показано устройство для реализации спо.с.оба; на фиг, 3 - .TepMo.rpaHNia флуоресценции листа Alch Eitlla grossbeimii интенсивности све- ;чения; на фиг. 4 - кинетика затухани послесвечения листьев Alchimilla gro slveimii; Tia фиг. 5 и 6 - термограммы флуоресденпии различных биологически объектов.

Способ реализуется устройством (фиг. 1), содержащим по ходу луча

источник света, линзы, светофильтры, шторки, фотоприемтшк и регистрирующее устройство, отличающееся, тем,что .в него введены термоячейкя с датчиком температуры, скрещивающие светофильтры с возможностью возбуждать и в.ыде- лять флуо ресден ;ию обоих фотосистем, а также быстродействующий затвор с трехщелевой шторкой с возможностью их по.очередного открывания и закрывания.

Устройство (фиг. t) содержит три отсека (Л, Б, 15) в светонепроницаемую камеру 1, на основании ко.торой собрана оптико-механическая часть устройства. К отсеку В снаружи вмонтирован осветитель 2 с лампой нак.алива.ния 3 конденсатором i, жидкостным (CuCl) 5„1 и стеклянным 5.2 светофильтрами, а внутри этого отсека прикреплены jiHii3a 6 и призма 7, которые совместно с призмами 8 и 9 (отсек Б) формирует пучок возбуждающего света, затвор lOj датчик, температуры 11, фотоумножитель 12, светофильтр 13.

В отсеке Б смонтирован также затвор 10 со щелевой шторкой 11 (фиг.1 и 2), состоящей из кожуха шторки 14 с двумя окошками для возбуждающего света 15 и регистрации люминесценции 16. ШторКа 11 выполнена в виде ш.1астицки с тремя щелями: одна общая 17 для регистрации послесвечения и флуоресценции, а две другие - для возбуждения флуоресценции 18 и послесвечения 19. Затвор снабжен такжедвумя пружинами 20 и 21, заводно-дусковым рычагом 22, приводящим затвор в действие, двумя защелками 23.1, 23.2 с пружинами 24.1, 24.2, фиксирующими положение шторки, и двумя пусковьми шнурами 25 .1,25.2.

В отсеке Б прикрепляется также съемная массивная термоячейка 26,вы- полненная из латуни с внутренним электрическим нагревателем, обеспечивающим равномерный нагрев (3 С в минуту) , снабженная объектодержателем. с Датчиком температуры 11.

В отсеке А вмонтированы фотоумножитель (ФЭУ) 12 и светофильтр 13 для регистрации люминесценции. Питание ФЭУ осуществляется высоковольтным выпрямителем 27., для усиления сигнала ФЭУ использован усилитель постоянного.тока 28, а регистрация проводится на самописце 29 или на осциллографе 30. Для питания осветителя и термоячейки использован феррорезонансный стабилизатор и трансформатор 31, 32, 33,

Устройство работает следующим образом.

Для регистрации послесвечения 5 включается электропитание устройства Сфиг, 1), затем интактлый фотосикте- зирующий объект с держателем помещается в термоячейку 26, и щелевая шторка 10 приводится в рабочее поло- 10 жеиие. -Для этого заводно-пусковым рычагом 22 шторка вытягивается,при

этом натягивалотся пружины 21,1, 22,2, и заведенная шторка удерживается защелкой 23, При этом шторка закрывает ts

окно 1.6 фотоумножителя и открывает окно возбуждающего света 15, Свет от заранее включенного источника с помощью оптических систем линзы 4, светофильтра 5,1, 5.2, линзы б,призм 20 7, 8,9, фокусируется на образец. После Ш-20 с освещения образца нажимом на рычаг 22 освобождается шторка 10 от защелки 23 и под действием, пружины 20, 21 шторка .мгновенно 25 (0,005 с) закрывает окошко возбуждающего света 15 и одновременно открывает окошко фотоумножителя 16,11ри . этом свет послесвечения фотосинтезиНа фиг, 3 криво 34 представлен термограм- а флуоресценции листа Alchimilla grossheimii, произраста щего в высокогорных условиях (3200 от уровня моря), а кривой 35 - тер

рующего образца (точнее от фотосисте-зо мограмма растения, произросшего з

мы II) переходит через светофильтр и попадает на фотоумножитель, кающий фототок усиливается с помощью усилителя постоянного тока, и на осциллографе или на. самописце регистрируется кинетика затухания интенсивности свечения от времени

35

долинных условиях (1100 м от зфовн моря),

Относительное содержание фотоси тем (ОСФ) определяется по отношени

ОСФ i|S , es

Для изучения зависимости послесвечения от температуры включением тер- моячейки 26 образец нагревается до желаемой температуры, и затем регистрируется кинетика послесвечения.

Для регистрации (флуоресценции и термоиндуцированного изменения 4 луо- ресценции образца достаточно во второй раз нажать на рычаг 22, При этом отодвигается защелка 23 и шторка 10 окончательно продвигается внутрь кожуха, свет источника 3 проходит от щели шторки 19 на образец для возбуждения флуоресценции. Одновременно /включается самописец 29, термоячейка 26 с датчи1сом температуры J1, и записывается интенсивность флуоресценции

в зависимости от температуры.

Пример 1, Для определения относительного содержания фотосистем фотосинтезирующего объекта регистрируют интенсивность стационарной (Jxny ресценции в зависимости от тe fпepa- туры в интервале 25-27°С, Цри этом образец нагревают с постоянной скоростью (примерно 3 град/MinO , Флуо- ресценцшо объекта возб ткдают таким образок, чтоГ и ФС-11 возбужда лись одновременно, что осуществляется с помощью светофт-шьтра в диапазоне 400-550 нм, а интенсивность флуоресценции ФС-1 и ФС-11 регистрируют на 650-770 нм через красньш свето- ф1-шьтр.. Нами исследована .зависимость флуоресценции от температуры около 100 листьев ра стений phasolus vulga- ris и Alchiniilla grossheiraii,

Б табл, 1 представлены данные из- м.ерений по одноьгу типичному ли.сту.

Как видно из табл, 1, в области температуры 45-70°С интенсивность флуоресценции резко возрастает и пики обнаруживаются при Т 55 и Т .,

На фиг, 3 криво 34 представлена термограм- а флуоресценции листа Alchimilla grossheimii, произрастаю- щего в высокогорных условиях (3200 м от уровня моря), а кривой 35 - тер5

0

5

долинных условиях (1100 м от зфовня моря),

Относительное содержание фотосистем (ОСФ) определяется по отношению

ОСФ i|S , es

Для высокогорных растений отношение ФС-11 и ФС-1 составляет 1,041, а для растений долины - 0,947. Из приведенных соотношений видно, что у образца, произраставшего в условиях

высокогорья, ФС-1 меньше, чем ФС-11. I.

Относительная функциональная активность хлоропластов (Л) определяется по отнршеншо

A-i .S.

- 55 i65°

С падением величины отн.ошения, начиная с едини :,, функциональная активность повьшшется. Для высокогорных образцов оно составляет 0,888, а ,для растений, произрастатощих в условиях долины, составляет 0,842, Таким образом, относительная функциональная активность хлоропластов в высокогорных условиях гораздо ниже.

51254

Пример 2. Для определения относительной функциональной активности эти, между фотосистемами регистрируют послесвеченпе листьев в зависимости от температуры и по отношению

.. т,, I.

.0/1450 aк сим1 1-5ов

судят об

5ТЦ

активности.

На фиг. А представлена кинетика затух.ания послесвеченип листьев lchimilla grossheimii, произраставих в условиях высокогорья при комнатной температуре - кривая 36,.при .-кривая 37. К|1ивой 38 к 39 срр.тветственно представлены .послесвечения у растент, произраставших в условиях долины,, Односнтелъная функциональная активность ЭТЦ между ФС у образцов высокогор1 ых условий состав- 0,500, а в условиях долины - 0,442, т.е, у растений, произраставших в условиях,активность значительно ниже.,

П р и м ер 3, С целью иллюстра- ЦП1 преимущества предлагаемого спо- соба приведены результаты исследования ио . 1зучен1по термоиндуцироззанного изменения вькода стационарной флуо- ресцснции при этапах форьа - рования или при селектив.ном разрушении фотосистем,

.На фиг, 5 нредставлеггы термогра)- -пл (флуоресценции нормальньк (крив.ая 40) и этиолированных листьев ячменя . (кривая 41), Как видно, иа первом этапе формирования мембран преобладает ФС-1 , При Формировании фотосин.- тетического аппарата сначала.формируется ФС-1, а затем ФС-И, а у нормального листа фС-11 преобладает над ФС--1,

На фиг, 6 представлены термограм- мь1 флуоресценции нормального листа фасоли до .(кривая 42) и пос.ле o6jiy4e ния (крив.ая 43) рубиновым лазером (11. .6943 Л, 4 Ю Вт/м), Под действием излучения рубинового лазера прои.сходит в основном селективная деструкция Ф.С-1,. о чем свидетельствует исчезновение пика в области 65°С,

При м ер 4, Разработанный способ исследования фотосинтезирую- щих объектов можно успешно прт генять для определения генетической устойчивости растений к экстремалтьным воздействиям пкружпюшей среды. Для определения устойчивости растений к действиям ортгцательпой температуры опытный вариа)5т растения подвергает действию отрицательной температуры (3 мин - ) в холодильную камеру, Регистрируют зависимость интенсивности флуоресценции от температуры опытных и контрольных листьев, а генетическую устойчивость (ТУ) определяют по сиотношегипо

, ГУ -J-fS --- .100%

t

где I

55

56

1.5 I sинтенсивность флуоресценции ошлтного образца при 55°С и 25°С соответственно;

интенсивность флуоресценции контрольного образца при и 25°С. В табл, 2 сопоставлены данные флуоресцентньпс показателей генетической устойчивости растений с известной УСТОЙЧИВОСТЬЮ к отрицательным температурам.

Как видно из приведенных данных, высокогорные растения по сравнению с растениями, произрастаюпщми в условиях долины, обладают более высокой устойчивостью к низким температурам, т.е, высокогорные растения более морозоустойчивы.

Таким образом, изобретение позволяет провести точный анализ фотосистем и.их функционирования, значительно уменьшить трудоемкость работы и повысить информативность за счет проведения анализа.на живых фотосинте- зирукнцих объектах.

Формула изобретения

Способ исследования биологических объектов путем облучения объекта и измерения вторичного излучения, о т- л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности и информативности за счет выявления преобладания в объекте фотосистемы I или фотосистемы II и для определения функ- диокалькрй активности хлоропластов и генетической устойчивости растений, объект возбуждают излучением в диапазоне длин волн 400-500 км и регистрируют зависимость интенсивности флуо- ресцетгщш образца от температуры в диапазоне длин волн 650-770 tw, и селектируют фотосистемы по пикам.при этом первый пик при температуре 50 О

60 с соответствует фотосистеме II, а второй пик при температуре 60-70 С - фотосистеме I, и определяют по фор112543608

мулам относительное содержяние фото-т /т

систем (ОСФ):ГУ -15l i il ,00% .

,5 Цб

ОСФ - . i5 интенсивность ф.пуорьс ценции исследуемого

функциональную активность(А) хлоро- объекта при 5;5 с и

пластов: 25 с соответственно;

д 1,л° - /5 интенсивность фпуорес 5,б5 ценции контрольного

генетическую устойсивость(ГУ) расте- 10 объекта при и

НИИ25 С соотв:етственно.

Таблица Температура, СTzspo Г 33 Тдо 1 45 ТзО Т55 60 I 63 70

Интенсивность флуоресценции, 1о,„.ех

Phasolus vulgaris 64 63 63 77 112 128 110 99 83

Alchimilla grosshetmii113 114 113 116 120 130 121 136 117

Вид растений

Бодяк (произрас- тавщий на высоте 3300 м)

Бодяк (произрас- тавщий на высоте 1000 м)

Одуванчик высокогорный

Вероника высокогорная

Фасоль

Кукуруза

Таблица 2

Генетическая морозоустойчивость (ГУ),

Изобретение относится к способам исследования биологических объектов и может быть использовано для комплексного анализа фотосинтезиру- ющих объектов. Целью изобретения является повьшение точности и информативности анализа. Цель достигается за счет построения термограмм флуоресценции. Для выявления преобладания в объекте фотосистемы I или фотосистемы II объект возбуждают в диапазоне длин волн 400-550 нм. Затем регистрируют зависимость интенсивности флуоресценции образца от температуры в диапазоне длин волн 650 - 770 нм. На термограммах получают - пики, соответствующие фотосистеме I и фотосистеме II. Расчитаны относительные содержания фотосистем. 6 ил. 2 табл. сл с IND со

20 SO 40 50 60 10 Т°С (Риг.з

У om.eu.

Z5

20

Г5 JO

5

О

15 30 t.ccff. Фиг.

от. ед.

100

90 so

70

во

50 W

W го ю

20 30 fD 50 so 70 ГС Фаг.5

; т. so.

WO

30

W

70

60

50

0

30

20

W

W ZO iiO 50 60 70 T C (Put.ff

Редактор В, Ковтун Заказ А713/47

Составитель Б. Широков

Техред А.Кравчук - Корректор С. Черни

Тираж 778Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-г35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г Ужгород, ул. Проектная, 4

(-I-у1