Способ определения липополисахаридных антител против грамотрицательных микробов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к области медицины, в частности инфекционной иммунологии, и может быть использовано для определения антибактериальных противог липополисахаридных антител (ЛПС-антител).

Тяжелые токсические состояния и токсические шоки при бактериальных инфекциях и сепсисе связаны с разрушением бактерий и освобождением эндотоксина. Антибиотики, которые широко применяют при серьезных грамотрицательных инфекциях, вызывая разрушение бактерий, способствуют освобождению эндотоксинов, попаданию их в кровь и ухудшению состояния больных.

Эндотоксины грамотрицательных бактерий имеют сложную структуру и состоят из белка и ЛПС. ЛПС условно разделяют на

три части: 0-специфическая часть, кор и ли- пид А. 0-специфические цепи различных видов бактерий сильно отличаются друг от друга по химическому строению и этим определяют серологическую специфичность. Кор и липид А у различных видов грамотрицательных бактерий имеют подобные структуры. В настоящее время для всех энтеробактерий описано 6кор-типов(Н1-Р4, К-12 E.coll-тип nRa-тип Salmonella, отличающихся вариабельностью строения наружной части, проксимальной к 0-цепи. Внутренняя область кор, проксимальная к липиду А, имеет более общее строение. Липид А является наиболее консервативной частью молекулы и представляет собой ди- сахарид, состоящий из двух глюкозамино- вых остатков, к которым присоедини цепи жирных кислот, фосфат и этзноламин В нах4

S3

ч ел ю

стоящее время детально установлена структура двух типов липида А: Coli-тип и Salmonella-тип. Однако авторы предполагают наличие 4 типов липида А, другие сообщают о микрогетерогенности молекул липида А, различающихся по количеству цепей жирных кислот и количеству замещений фосфатом и этаноламином.

Липид А с укороченной частью кор, состоящей из двух молекул КДО (2-кето-З-де- зоксиоктоновая кислота) встречается в структуре ЛПС практически всех грамотри- цательных микроорганизмов. Именно эта часть молекулы ЛПС отвечает за токсичность эндотоксинов. Липид А нерастворим в воде, а присутствие двух молекул КДО кор-области делает его молекулу водорастворимой. Такое строение ЛПС (липид А + 2 молекулы КДО) обнаружено в Re-мутантах бактерий, которые утратили некоторые ферменты и поэтому неспособны включать 0- специфическую цепь и значительную часть кор в ЛПС.

Антитела к Л ПС из S-форм бактерий при парентеральной иммунизации животных образуются только к О-специфической цепи, но не к кор или липиду А и поэтому не могут нейтрализовать токсическое действие хор и липида А. Парэнтеральная иммунизация ЛПС кор-дефектных мутантов Ra-Rd вызывает образование антител, специфичных к терминальным углеводным остаткам, а антитела против субтерминальных и глубоких структур кор или липида А не образуются. Наибольший практический интерес в плане перекрестной защиты представляют антитела к липиду А и ЛПС Re-мутантов, состоящему из липида А и двух молекул КДО, структур, обнаруженных во всех гра- мотрицательных бактериях. Антитела, направленные против этих структур Re-мутантов должны нейтрализовать токсическое действие эндотоксинов всех грамот- рицательных микробов. И при проверке оказалось, что среди всех испытанных антител к R-мутантам (Re-Re) перекрестно защищать животных от гибели могли только антитела к Re-мутанту S. mirtnesota и Re-мутанту Е. coll. За рубежом имеются данные по применению плазмы или сыворотки крови с повышенными титрами ЛПС-антител больным с токсимией и сепсисом. Смертность больных сепсисом составляет обычно 60-80%. Применение плазмы или сыворотки с повышенными титрами ЛПС-антител значительно увеличивает выживаемость больных при сепсисе.

Известен способ определения антител к ЛПС методом РПГА на основе диагности- кума с Re-гликолипидом S. minnesota. Однако, отобранные на его основе сыворотки крови обнаруживали слабый протективный эффект на мышиной модели. При иммунизации добровольцев кипяченым Re-мутантом

S. minnesota не обнаруживали повышения титров в Re-гликолипиду, т.к. антиген был маскирован примесями.

Прототипом можно считать работу, в которой определение ЛПС-антител проводят

0 методом ИФА. При этом используют ЛПС, полученный из S-форм бактерий по методу Вестфаля. При таком определении ЛПС-ан- титея имеется ряд недостатков: во-первых, с помощью ЛПС S-форм бактерий выявля5 ются антитела к О-специфической цепи, принадлежащие к lgG-классу, которые являются специфичными для каждого вида и даже штамма микробов, во-вторых, антитела против кор и липида А, общие для грамотри0 цательных микробов, принадлежащие к fgM-классу, не выявляются совсем, и, в- третьих, используется недостаточно очищенный антиген, т.к. препараты ЛПС по Вестфалю содержат примеси (до 3% белка

5 и 3% нуклеиновых кислот), что затрудняет выявление ЛПС-антител. Сыворотки с повышенными титрами ЛПС-антител в работе- прототипе были более эффективны в лечении сепсиса, чем иммуноглобулины

0 lgG-класса, полученный из них, так как основная защита от токсического действия ЛПС связана с IgM классом антител.

Целью настоящего изобретения является повышение точности способа определе5 ния ЛПС-антител за счет выявления общего для грамотрицательных бактерий антигена. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена в ИФА используют ЛПС из Re-мутанта Salmonella minnesota, не со0 держащий примесей белка, нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов (других, кроме липида А). О-специфической цепи, частей кор (кроме двух молекул КДО). Антиген ЛПС из Re-мутанта может быть получен лю5 бым из известных методов получения ЛПС и затем доочищен, чтобы гарантировать отсутствие в нем примесей. Однако, препарат ЛПС получают наиболее высокой степени чистоты, если выделение ЛПС из Re-мутанта

0 проводят с фенол-хлороформ-петролейным эфиром по методу Galanos. Кроме высокой степени очистки препарата ЛПС этот метод гарантирует и хороший выход - до 5,5%, тогда как по методу Вестфаля выход - 0,6%.

5 Доказательство отсутствия в антигене примесей белка, нуклеиновых кислот и полисахаридов проводят любыми известными методами. Гарантией высокой степени чистоты ЛПС Re-мутанта служит содержание гексозаминов, равное 17% или 1030 нмоля/мг (при высушивании до постоянного веса), что соответствует теоретически вычисленным.

Наличие примесей в препарате ЛПС наиболее быстро контролируют высокочувствительным методом с карбоцианиновым красителем (7) по визуальному изменению цвета и сдвигу максимума поглощения в видимой части спектра, указывающего на присутствие белка, нуклеиновых кислот или полисахаридов.

Антиген, полученный по методу Galanos хорошо растворялся в воде, хорошо сорбировался на планшеты для ИФА и после обработки щелочью хорошо сорбировался на эритроцитах при приготовлении диагности- кума. Использование этого антигена в ИФА доказывает, что он выявляет антитела IgM- класса, т.к. работы системы требуются конъ- югаты антител к lgM-человека.

При выделении из антигена липида А получают нерастворимый препарат, использование которого в качестве антигена усложняет способ, т.к. ведет к необходимости перевода липида А в растворимую форму,

Постановку ИФА осуществляют обычным образом.

Пример 1. Определение содержания ЛПС-антител на основе ЛПС Re-мутантэ S. mlnnesota методом ИФА.

Высушенную спиртом микробную массу Re-мутанта S. mfnnesota трижды экстрагируют смесью 90% фенол (свежеперегнанный)-хлороформ-петролей- ный эфир (кип. 40-бО°С) в соотношении 2:5:8. Объединенные надосадочные жидкости упаривают в роторном испарителе для удаления хлороформа и петролейного эфира. К оставшемуся фенолу, начинающему кристаллизоваться, добавляют воду до полного его растворения. Далее воду добавляют по каплям до выпадения в осадок ЛПС, соблюдая осторожность, чтобы не вызвать расслоения фенола избытком воды, Осадок ЛПС собирают центрифугированием, промывают 80% фенолом и трижды эфиром, досушивают в вакууме.

Доказательство отсутствия в антигене примесей белка, нуклеиновых кислот и полисахаридов проводят карбоцианиновым красителем по определению максимума поглощения антигена в видимой части спектра. Антиген имел максимум поглощения при 467 нм, что свидетельствовало об отсутствии примесей, и превышал процентное содержание ЛПС в стандартном препарате ЛПС из 055: В5 фирмы Difco, США, полученному по методу Вестфаля.

В препарате ЛПС определяли содержание гексозаминов. которое оказалось равным 17% на сухой вес препарата. Такой высокоочищенный препарат был использован в ИФА в качестве антигена для нанесения на планшет или для приготовления

диагностикума для постановки РПГА.

При постановке ИФА способ осуществляют следующим образом: очищенный антиген наносят в рабочей концентрации 5 мкг/мл в лунки полистироловых планшетов

0 для ИФА в объеме 0,2 мл, В качестве сорбирующего буфера используют 0,05 М карбо- натно-бикарбонатный буфер рН 9.6, Сенсибилизацию пластин проводят в течение 16-20 часов при темпеоатуре 4°С, после

5 чего отмывают фосфатно-буферной смесью, содержащей 0,05% твин-20. Затем наносят исследуемые образцы сывороток крови, или препаратов иммнуноглобулинов, или осадка Б, получаемого при фракционировании

0 сывороток крови по метолд Кона (фракция Ш) в разведении 1:50-1:1600, после инкубации отмывают и наносят коньюгат антител к иммуноглобулину М человека с пероксида- зой хрена. Время инкубации сывороток и

5 конъюгата - 1 и 1,5 ч при 37°С. После отмывки ферментативную реакцию проявляют, добавляют субстрат, содержащий 0.003% Н20а и 0-фенилендизмин (ОФД) в 0.05 цит- ратно-фосфатном буфере рН 5,0. Через 30

0 мин стояния реакцию фиксируют добавпе- нием 14% H2-S04 и учет интенсивности окрашивания проводят на фС70мотре Titertek Multlskan при 492 нм.

Методом ИФА обследовано 34 пулевых

5 сывороток крови объемом по 5 л слитых от 30-40 Индивидуальных порций из них - 13 донорских и 21 плацентарные сыворотки, из 17 городов РСФСР, поступающих на предприятие МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского

0 для фракционирования по методу Конз. Результаты титрования обнаружили содержание ЛПС-антител в пуловых сыворотках в титрах от 1:50 до 1:1600. Стабильно высокие титры обнаружены в пуловых сыворотках из

5 г. Ленинграда (титр 1:800 в 6 из 7 исследованных образцов), на втором месте по высоте титров оказались пулевые сыворотки из г. Пскова (титр 1:400 в 2 из 2 образцов). В образцах сывороток из г. Архангельска тит0 ры 1:200 были обнаружены в 3 из 4 исследованных, а в образцах из г. Смоленска - 1 образец 1:200, другой 1:1600.

При анализе заболевае1мости острыми кишечными инфекциями неустановленной

5 этиологии, дизентерией и сальмонеллами за последние 2 года именно в этих городах отмечена высокая частота заболеваний, а высокие титры антител к кор и липиду А сохраняются в течение 2-3 лет. Следовательно, именно сывороточное сырье из местностей с высоким уровнем заболеваемости, вызванной грамотрицательными микробами, можно рассматривать как источник для получения иммуноглобулиновых препаратов направленного действия.

П р и м е р 2, Определение содержания ЛПС-антител в РПГА с диагностикумом на основе ЛПС из Re-мутанта S. mlnnesota.

Диагностикум для постановки РПГА готовят следующим образом: 5 мг антигена обрабатывают 1,25 мл 0,02 М раствора NaOH при 37°С в течение 16ч, после чего нейтрализуют 0,02 М раствором НС и доводят объем до 10 мл физраствором, после чего смешивают с 1 мл плотного осадка отмытых физраствором свежих эритроцитов. Смесь инкубируют 2 ч при 37°С периодически встряхивая, после чего эритроциты 3 раза отмывают физраствором и доводят объем до 50 мл.

Методом РПГА обследовали 34 теуло- вых сыворотки, 12 осадков Б и 10 индивидуальных сывороток от больных пиелонефритом, Во всех исследованных образцах обнаружены ЛПС-антитела в титрах от 1:80 - 1:640. Определения РПГА проведены параллельно с методом ИФА в одних и тех же образцах и обнаружено значительное совпадение результатов титров (расхождение между РПГА и ИФА не боле, чем в два раза).

Результаты определения содержания ЛПС-антител на основе предлагаемого ан- тигена-ЛПС из Re-мутанта S. minnesota методами ИФА и РПГА в 10 индивидуальных сыворотках больных пиелонефритом приведены в таблице в сравнении с 0-спе- цифическими антителами, определяемыми с коммерческими ЛПС из S-форм микробов.

Из данных таблицы видно, что содержание О-специфических антител не всегда коррелирует с содержанием анти-Ре-ЛПС-антител в сыворотках крови у индивидуальных больных. Эта разница стирается при сравнении пуловых сывороток и осадков Б.

РПГА проще в исполнении, чем ИФА, но менее экономична, т.к. расход антигена в 100 раз больше.

Технико-экономическая эффективность изобретения.

Изобретение может быть использовано для определения состояния иммунной системы в динамике у больных серьезными грамотрицательными инфекциями и сепсисом. Нарастание ЛПС-антител у таких больных свидетельствует о том, что иммунная система больного справляется с инфекцией и отвечает выработкой антител. Уменьшение ЛПС-антител у больных сепсисом - пяохой прогностический признак, приближение летального исхода,

Изобретение может быть применено для обследования нанесения для выявления группы риска, со сниженными титрами

ЛЛС-антител, лиц, которые могут погибнуть от сепсиса. Особенно велик будет процент таких у подвергшихся радиоактивному облучению.

Можно использовать изобретение и для

выявления лиц с высокими титрами ЛПС-антител, которые могут быть донорами крови, так как такие Re-ЛПС-антитела сохраняются в организме в течение 2-3 лет на высоком уровне.

Изобретение может быть использовано на производстве препаратов крови путем отбора сывороток с повышенными титрами Re-ЛПС-антител и изготовления из них иммуноглобулиновых препаратов lgM-кяасса.

эффективных в лечении токсемии и сепсиса, вызванного любыми грамотрицательными микробами.

Показано, что для этих целей может быть использован бросовый осадок Б, получаемый при фракционировании крови по методу Кона, а кровь для фракционирования следует брать из местностей с высоким уровнем заболеваемости за последние 2-3 года, вызванной грамотрицательными микробами,

Формула изобретения Способ определения липополмсахзрид- ных антител против грамотрицательных микробов, включающий выделение антигена, нанесение его на носитель, внесение исследуемой сыворотки и учет иммунологической реакции при иммуноферментном анализе, отличающийся тем. что, с целью повышения точности способа за счет

выявления общего для грамотрицательных бактерий антигена, в качестве антигена используют Re-мутант Salmonella mlnnesojta

при уровне содержания гексозаминов 17%.

- В качестве антигена не планшет наносили коммерческий ЛПС из Е.соН 055 : 85, полученный по методу Вестфаля, фирмы Dlfco США.

Изобретение относится к области медицины, в частности инфекционной иммунологии, и может быть использовано для определения антибактериальных противо- липополисахаридных антител (ЛПС-антител). Целью изобретения является повышение точности рпособа определения ЛПС-ан- тител за счет выявления общего для грамотрицательных бактерий антигена. Поставленная цель достигается тем, что в качестве антигена в ИФА или для приготовления диагностикума для РПГА используют ЛПС из Ремутачта Salmonella rninnesota, не содержащий примесей с чистотой содержания гексозаминов, Изобретение можно использовать на производстве препаратов крови для отбора сывороток с высокими титрами ЛПС-антител, которые можно применять для лечения септических больных. Изобретение может быть использовано и для наблюдения в динамике за септическими больными, что представляет ценность ввицу быстроты получаемого ответа 1 табл.

Коммерческий 0-диагностикум.