Штамм вольвоксовой водоросли DUNaLIeLLa SaLINa TeoD CALU-834-продуцент белково-каротиновой биомассы Советский патент 1987 года по МПК A23K1/00 A01H13/00 C12N1/12 

Изобретение относится к штаммам микроорганизмов-продуцентов белково- каротиновой биомассы и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения белка и |9 Каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добаво в рацион животных и рыб, а также для утилизации отходов агропромьшленного производства.

Целью изобретения является получение штамма одноклеточной зеленой водоросли Dunaliella saline Teod, характеризующегося более высоким синтезом |П,-каротина и белка в биомассе

Штамм выделяют из водорослей, собранных в прибрежной зоне лимана Са- сык. Очищают штамм от сопутствующих водорослей путем многократного пересева на жидкой и агариэованной ере- дах Масюк,- г/л: NaCl 116; MgSO. 5; KNOj 2,5; 0,2; вода - остальное .

Морфолого-культуральные признаки штамма. При выращивании на жидкой ср де клетки одиночные, активно двигаются, овально-грушевидной формы, размерами 4,4x11,0-6,7x18,7 мкм. Хлоропласт чашевидный, занимает почти всю периферическую базальную часть клет- ки, пиреноид один, крупный, окруженный крахмальными зернами, стигма и основания жгутиков в передней части клетки хорошо различимы в оптическом микроскопе. Жгутики в 1,5-2 раза дли нее клетки, изогнутые к ее базальной части.

При истощении питательной среды, неблагоприятной температуре и освещении клетки прекращают движение, при- обретают округлые очертания диамет- ром 13-20 мкм, покрываются тонким слоем слизи. Отдельные клетки продолжают делиться и образуют пальмел- левидные скопления, другие превра- щаются в цисты с утолщенными оболочками, зернистым содержимь№1 оранжево- красного цвета.

На агаризованной среде клетки более или менее округлых очертаний 9-16 мкм в диаметре, с крупным зеленым хлоропластом и стигмой, одним пиреноидом, окружены слоем слизи. Клетки после деления иногда остаются рядом, образуя скопления.

На жидких средах суспензия водоросли зеленого цвета, при сильном освещении с желто-оранжевьгм оттенком. Клетки не прирастают к стенкам сосуда, суспензия при отсутствии перемешивания концентрируется в нижней части сосуда, образуя осадок, который легко ресуспендируется при встряхивании или перемешивании.

На агаризованной среде образует колонии зеленого цвета, диаметром 1-2 мм, окруженные иногда каемкой, состоящей из бактерий. При культивировании на жидких питательных средах в стационарных условиях штамм образует нежную пленку маслянистой консистенции, которая легко разрушается при перемешивании.

Штамм размножается путем продольного деления клеток в подвижном или неподвижном состоянии, преимущественно в ночное время. В пальмеллях клетки также размножаются делением.

При интенсивном культивировании клетки делятся вне прямой связи с режимом освещения.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм хорошо развивается на минеральной среде следующего состава, г/л: NaCl 120,0; NaHCO 2 ,0; MgS04-7Н20 0,75; NaNOj 0,5; KCl 0,15; 0,05; Fe-EDTA 0,05 мл, 0,05 мМ раствора, вода водопроводная - до 1 л, рН 8,5-8,8, а также на средах, содержащих сточные воды животноводческих комплексов (содержание органического вещества по ХПК не более 1000 мг 0 / л), при добавлении 6-12% хлорида натрия и 0,2% бикарбоната натрия при 27- , непрерывном освещении (20 тыс. эрг/см -с) и перемешивании.

Штамм характеризуется высокой продуктивностью в условиях интенсивного культивирования. На минеральной среде биомасса дуналиеллы на шестой день культивирования достигает 1,8 г/л сухого вещества, а на средах, приготовленных на основе сточных вод животноводческих комплексов, - 1,6 г/

На свежей питательной среде клетки D.salina Teod. CALU-834 двигаются достаточно активно в разных направлениях. По мере утилизации основных компонентов питательной среды (в первую очередь, азота и фосфора) в накопительной культуре примерно на 10- 12 сут большая часть клеток прекращает движение, но сохраняет жизнеспособность, переходя в пальмелле- видное состояние или в стадию цисты. Некоторая часть клеток подвергается лизису. Повынюние температуры вьше () ведет к тем же последствиям.

но возрастает процент отмирающих клеток.

При слабом освещении (менее 3 тыс. эрг/см с) .клетки культур в возрасте 6-10 сут имеют ярко-зеле- ную окраску и активную подвижность. При освещении менее 200 эрг/см -с движение клеток замедляется или пол- ностью прекращается, но клетки сохраняют стигму и жгутики. При воз- обновлении экспонирования при сильном освещении клетки быстро (за 5- 10 мин) восстанавливают активное движение.

Штамм способен развиваться при очень сильном освещении (30- 100 тыс.эрг/см - с), при этом возрастает биопродуктивность, клетки становятся ярко-оранжевыми вследствие биосинтеза преимущественно уЭ каро- тина.

Степень чистоты штамма. Штамм D. salina Teod. CALU-834 выделен в альгологически чистой культуре.

При массовом выращивануи не за- грязняется другими видами водорослей в связи с высокой селективностью питательной среды.

Влияние рН и температуры среды на рост культуры показано в таблице.

Клетки сохраняют жизнеспособность при отрицательных температурах (-3)- (-5)°С на среде с 12% хлористого натрия.

Отношение штамма к углероду и азоту. Штамм D. salina Teod. CALU-834 способен использовать в качестве источника углерода бикарбонат, а также углекислый газ, углеводы (в основном моносахара), глицерин и др.

В качестве источника азота лучшим является нитрат, но водоросль способна использовать и аммонийный азот в концентрациях не более 25-50 мг/л..

Штамм культивируют на сточной воде животноводческого комплекса (СВЖК) Перед использованием для культивирования D.salina Teod. CALU-834 СВЖК отстаивают в течение 12-24 ч, затем разбавляют до ХПК (химическое потребление кислорода) 750-1000 мг/о Oj .

После этого питательная среда имеет рН 7,8-8,3 и следующий состав, мг/л:,

.Суммарны11 азот 90-140

Суммарны фосфор 70-90

Кальций80-90

Калий120-130

Магний100-150

Бикарбонат300-500

Сульфат400-500

К указанной среде добавляют 12% хлорида натрия и 0,15% бикарбоната натрия, перемегаивают до полного растворения солей, после чего готовую среду разливают по соответствующим емкостям, производят.инокуляцию суспензий штамма D. salina Teod.CALU-83

Сухая биомасса дуналиеллы имеет состав, %: белок 38,43; глицерин 31- 36; уЗ Каротин 6-9; зольные вещества 5-9.Используется штамм D.salina Teod. CALU-834 следующим образом.

Пример 1. В сосуды объемом 2 л с жидкой минеральной средой следующего состава, г/л: NaCl 120,-0; NaHCOj 1,0; MgSO -7H20 0,75; NaNOj 0,5; KCl 0,15; 0,05; Fe-EDTA 0,05 мл 0,5 мМ раствора, рН 8,5-8,8, приготовленной на водопроводной воде, вносят инокулят дуналиеллы из расчета 0,3 г/л сухой массы.

Культивирование осуществляют при постоянном перемешивании, освещении 15 тыс эрг., температуре 27- 29°С и ежедневном добавлении по 0,2 г/л бикарбоната натрия.

Содержание каротина определяют по ГОСТу, Для экстракции /,-каротина вместо петролейного эфира (гексана, бензина) используют хлороформ, а его количество в элюате определяют на спектрофотометре при длине волны 464 нм.

Продуктивность дуналиеллы на шестые сутки составляет 1,8 г/л сухой массы, содержащей, %: белок 38, глицерин 36, -каротин 8,2.

Пример 2. Суспензию дуналиеллы вносят в питательную среду, содержащую сточные воды животноводческих комплексов (ХПК 750 мг/л О., 12% хлорида натрия и 0,1% бикарбоната натрия), из расчета 0,3 г/л сухого вещества. Водоросль культивируют при постоянном перемешивании и освещении 15 тыс. эрг/см, с, температура 27- и ежедневном добавлении 0,2 г/л бикарбоната натрия.

Продуктивность на шестые сутки составляет 1,6 г/л сухой массы дуналиеллы, содержащей, %: белок 43, глицерин 31 и -каротин 5,6.

Пример 3. Пр едлагаемый штамм культивируют в условиях примера 1. Через 6 сут биомасса достигает 1,8 г/л сухой массы. Часть суспензии (25%)

ежесуточно изымают и вместо нее вносят эквивалентную порцию свежей питательной среды. На следующие сутки биомасса водоросли достигает исходны величин. Такая полунепрерывная культ ра дуналиеллы поддерживается в течение месяца.

В сопоставлении с известным штаммом Pedinomonas tenuis Massjuk N 153 биомасса которого на 6-е сутки дости ,5 г/л и содержит 29,8% белка и 0,008-0,012% (80-120 мкг/г) каротинов, использование предлагаемого штамма D.Salina Teod. CALU-834 позволяет получить на шестые сутки 1,6- 1,8 г/л сухой массы, характеризующейся высоким содержанием белка (38- 43%) и особенно /i-каротина (5,6 - -8,2%), что значительно больше, чем в биомассе известного штамма, исполь зуя для этой цели как минеральную среду, так и среды, приготовленные на основе сточных вод животноводческих комплексов.

Преимущества предлагаемого штамма -D.Salina Teod. CALU-834 по сравнению со штаммом D.bardawil заключаются в следующем. . Штамм D.Salina Teod. CALU-834 отличается более высокой продуктив- ностью, чем D.bardawil АТСС 3,0861. При культивировании известного штамма в полунепрерывном режиме штагам D,bardaX 7il достигает максимальной биопродукции 30 абсолютно сухого вещества (АСВ), в т.ч. глицерина 10 г/м.сут и каротина 0,7 г/м исут. Штамм D,Salina CALU-834 согласно примеру 3 описания в условиях полунепрерывного культивирования дости гает 1,8 г/л или 180 г/м при выращивании в культиваторе с толщиной слоя суспензии 10 см (объем суспензии при этом равен 100 л).

6,3-7,0

1-2

ВНИИ1Ш

Заказ 2986/2

Производств.-полиграф., пред-е, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 0

0 35 40

5

При ежесуточном изъятии части суспензии (25%) продуктивность штамма составляет 45 г/м.сут АСВ, Биомасса содержит, %: белок 38; глицерин 36; /3-каротин 8,2 или соответственно 17,1 г/м сут белка, 16,2 глицерина и 3,7 -каротина).

Благодаря более крупным размерам клеток биомасса предлагаемого штамма легко отстаивается, а для ее полного отделения от культуральной- жидкости центрифугируют только 1/10-1/20 часть ее объема, содержащую клетки водоросли, а остальную часть среды используют повторно. Отделение биомассы известного штамма Р.tenuis Massjuk требует центрифугирования всей суспензии.

Кроме того, культивирование D.sa- lina Teod, CALU-834 возможно в средах, содержащих сточные воды животноводческих комплексов, а также в более широком диапазоне концентраций хлорида натрия (3-30%), Использование повьшзенных концентраций хлорида натрия предотвращает развитие грибов, зоопланктона, ракообразных, представляющих серьезную проблему при массовом культивировании водорослей.

Штамм Dunaliella salina Tepd- CALU-834 может быть использован для промышленного получения белка и д -каротина, а также глицерина.

Формула изобретения

Штамм вольвоксовой Ьодоросли Dunaliella salina Teod (коллекция водорослей Биологического научно-исследовательского института ЛГУ им. А.А. Жданова) CALU-834 - продуцент белково-каротиновой биомассы.

8,5-9,0

10,5-10,8

28-32

37-38

Тираж 530

Подписное

Изобретение относится к штаммам микроорганизмов - продуцентов бел- ково-каротиновой биомассы. Цель изобретения - получение штамма водоросли с высоким содержанием ft - каротина и белка. Полученньй штамм может быть использован в микробиологической про- мьпиленности для получения белка и /3 -каротина, в качестве кормовых, витаминных и биостимулирующих добавок в рацион животных, а также для утилизации отходов. Сухая биомасса клеток штамма содержит 38-43% белка, 31-36% глицерина, 6-9% /j-каротина, 5-9% зольных веществ. Штамм успешно размножается в сточных водах птицефабрик. 1 табл. (Л 00 ю 4 О5 to