Способ определения качества спермиев Советский патент 1987 года по МПК A61D7/02 A61B10/00 

Изобретение относится к биологии размножения животных и предназначено для лабораторных и клинических исследований в области криобиологии, ветеринарии и медицины.

Целью изобретения является повышение точности определения.

Пример. В питательную среду вводят тиазиновый красный и этидиум бромид в количестве 0,006 и 0,001 мае./о: соответстве- но. Затем отмеривают в пробирку в соотне- шении 1:10 сперму и питательную среду, содержащую флуорохром (например 0,01 мл спермы и 0,1 .мл среды), тщательно переме- 1пивают, наносят на предметное стекло каплю смеси и плотно накрывают покровным стеклом так, чтобы движение спермиев было ограничено. После этого препарат помещают под люминесцентный микроскоп (МЛ-2 или МЛ-3). При этом используют возбуждающий свет с длиной волны 365 нм, а ф. 1у- оресценцию наблюдают в области 500-700 нм. Препарат рассматривают под иммерсией при увеличении не менее 90x15 в отраженном свете. В поле зрения учитывают число (процент) поврежденных и нормальных спермиев. При этом на темно-синем фоне четко просматриваются более светлые спермин, которые относят к нормальным (акросома нормальных спер.миев несколько темнее головки, но светлее фона). При повреждении акросомы, ко1 да нарушена проницаемость ее мемб)аны, тиазиновый красный, проникая внутрь акросомы, вызывает ее свет. ю-салатное свечение. При более г.чу- боком повреждении акросомы, согфовождаю0

5

0

5

0

щемся нарушением ее морфологического строения, чаще всего приобретением шаровидной формы, тиазиновый красный вызывает ее интенсивное ярко-малиновое свечение. При повреждениях цитоплазматичес- кой мембраны спермиев этидиум бромид проникает в клетку и, связываясь с ДНК, вызывает ярко-малнновое свечение головки спермия.

Оптимальное соотнои ение в смеси тиа- зинового красного и этидиум бромида определяют следующим образом. В питательную среду (разбавитель спермы петухов ЛКС-1) вводят различные навески красителей, а также детергент дигитанин в конечной концентрации 1 мМ с цельк) повреждения у всех спермиев мембран головок и акросом

Результаты исследований представлены в таблице.

Для удобства учета интенсивности свечения поврежденных органелл спермиев при применении той или иной концентрации красителей в таблице приведена характеристика по 5-балльной , где 5 баллов отражают наиболее интенсивное свечение по врежденных акросомы и головки спермия; 4 балла - интенсивное свечение одной поврежденной органеллы (например акросомы) и ме}|ее интенсивное, но еще четко различимое свечение другой (например головки); 3 балла - недостаточно интенсивное свечение головки и акросомы или же достаточно интенсивное свечение одной органеллы при еле различимом свечении другой; 2 балла - слабое свечение г оловки и акро- 1 балл - еле различимое свечение спермиев.

Представленные в таблице данные сви детельствуют о том, что тиазоновый красный и этидиум бромид можно эффективно использовать в смеси в довольно широких пределах (0,003-0,012 мас.% и 0,0005- 0,002 мас.% соответственно). При этом оптимальная концентрация тиазинового красного в данной смеси составляет 0,005- 0,008 мас.%, а этидиум бро.мида - 0,0008- 0,0015 мас.%. Недостаточная концентрация красителей (или одного из них) в смеси, т.е. меньше нижнего предела, не обеспечивает четкой дифференциации структур спермия в связи со слабым свечением, а избыток (выше верхнего предела) приводит к увеличению интенсивности фонового свечения, что затрудняет наблюдение. Избыток одного красителя (например тиазинового красного ) маскирует люминесценцию другого (этидиум бромида), введенного в недостаточной концентрации.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет при необходимости дифференцировать в препарате спермии на нормальные (несветящиеся темно-синяя головка и акро- сома); с нормальной головкой (несветящаяся, темно-синяя) и поврежденной акросо- мой (светло-салатное или ярко-малиновое свечение); с поврежденной головкой (ярко- малиновое свечение) и неповрежденной ак- росомой (несветящаяся, темно-синяя); с поврежденной головкой и поврежденной акросомой (светящаяся светло-салатная акросома и ярко-малиновая головка или же ярко-малиновое свечение акросомы и

головки); с нормальной головкой (несве- тящаяся, темно-синяя) и отсутствием акросомы; с поврежденной головкой (ярко-малиновое свечение) и отсутствием акросомы;

отдельно расположенные друг от друга све- тяцщеся органеллы спермия (акросома, головка, хвостик).

Данная дифференциация с 1ермиев дает возможность более точно установить, а затем и устранить причину тех или иных повреждений. Это особенно важно при разработке режимов замораживания и оттаивания спермы, изучения токсичности криопро- текторов, разработке сред для хранения и замораживания спермы, режимов эксплуата

ции самцов, в клинической практике и т.д. Формула изобретения

Способ определения качества спермиев, включающий смещивание спермы с питательной средой, в которую вводят флуорохром этидиум бромид, и последующий анализ окрашенных спермиев под микроскопом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, в питательную среду дополнительно вводят флуорохром тиазиновый красный при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Флуорохром тиазиновый красный0,003-0,012

Флуорохром этидиум бромид 0,0005-0,002 Питательная средаОстальное а о качестве спермиев судят по повреждению их головки и акросомы.