Способ определения содержания живых микроорганизмов Советский патент 1983 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к микробиор1огии, в частности к методам определения живых микроорганизмов, и может быть использовано в микробиологической промышленности.

Известен способ определения числа живых микроорганизмов путем высева на питательные среды с подсчетом числа выросших колоний 1.

Недостатками данного способа являются длительность, составляющая от одного до -нескольких дней, и обязательное условие соответствия состава реды потребностям определяемых мик роорганизмов, что трудно выполнимо при определении смешанных популяций микроорганизмов из ферментеров и объектов окружающей среды

Извертен способ определения живых и мертвых бактерий путем окраски образца красителем акридиновым оранжевым и подсчета числа бактерий, еветясе.ихся красньм (мертвые) и зеленым (живые) светом {2J,

Недостатком этого способа являетс неоднозначность результатов/ обуслов ленная, в частности, наличием в продбах инактивированных клеток, сохраняющих ядерный компонент, которые окрашиваются красителем в зеленый цвет.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ определения содержания живых микроорганизмов в исследуемом образце микроорганизмов, предусматривающий приготовление суспензии микроорганизмов в водной cpesae.

Способ состоим из следующих, операций мазок бактерий подсушивают на воздухе, фиксируют в фиксаторе Кариуа 20 мин, после чего снова подсушивают на воздухе не менее . Прдсутенный мазок окрашивацот азур-эозчком ври 20С в течение 24 ч, затем промыВа1ют в днетилл.ированной воде, подсушивают на воздухе,5-10 мин, докрашивают раствором крас-1теля светлого зеленО1 о 1 мин, затем удаляют остатки краски, подсушивают и микроскопируют Живые клетки бактерий окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а мертвые KJiieTKH приобретают ярко-зеленую окраЬку 31.

Недостатками известного способ.а .являются большая трудоемкость и длительность (более 26 ч).

° Целью изобретения является ускорение и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что соглас.но способу определения содержания живых Микроорганизмов в исследуемом образце, предчусматриваквдем приготовление сураензии микроорганизмов в водной среде, суспензию микроорганизмов с кра1 ЕИвают красителем на мертвые клетки, ведут подсчет окрашенных мертвых клеток, затем суспензию инактивируют. путем нагрева при

70-100С в 0,5-5 шн или путем химической обработки., после чего ведут подсчет общего количества окрашенных мертвых клеток и по разнице двух.подсчетов определяют содержание живых клетон в суспензии.

Сущность способа заключается в следующих операциях: добавление к суспензии красителя, окраска в течение 3-5 мин, приготовление мазка для счета мертвых клеток, инактивация суспензии, содержащей, краситель, в течение 0,5-10 -мин, приготовление второго мазка для счета обш,его количества клеток, счет клеток в двух препаратах.

Одним из наиболее универсальных и удобных в работе красителей: на мертвые клетки является флуорохром примулин, окрашивакщий клетки различных классов микроорганизмов. Нертвые клетки дрожжей хорошо окрашиваются также флоурохррмом тиазинов1цм красным и абсорбционным красителем метиленовым синим,

Оптимальным режимом тепловой инактивации является нагрев суспензии при lO-lQffC 3 течение 0,5-5 мин (фиг. 1 И 2) .Применение более 1 изкой температуры,более короткого,и в ряде случаев более длительного нагрева приводит к уменьшению степени окраски клеток. При этом хорошее прокрашивание инактивированных клеток,отмечалось Для всех трех леречисленных красителей, причем окрашенные клетки хорошо видны, как в препаратах мазков, так и раздавленной капли .

Инактивация путем нагрева удобна тем. Что при небольшом времени нагрева практически не меняется объем клеточной суспензии, что облегчает расчет oличecтвa живых клеток.

Примером химической инактивации может служить обработка фенолом, которая .дает . наилучшие рёзул.ьтаты при концентрации фенола 6-12% (фиг. 3) причем достаточно даже 30 секундной обработки (фиг. 4) . Обработка меньши ми и большими концентрациями фенола приводит к ослабленной окраске клеток, кроме того, обработка большими концентрациями фенола в случае применения флуорохромов ведет к повышению люминесцекиии фона. Обработка фенолом путем добавления спиртового раствора или водной эмульсии приводит к хорошему окрашиванию клеток примулином и метиленовым синим (фиг. 3). После обработки фенолом можно готовить для счета как препараты сухих мазков, так и раздавленной капли .

Инактивацию можно проводить и другими дезинфектантами, например спиртом.

Инактивацию путем добавления жидкого химагента предпочтительнее проводить в тех случаях, когда по различным причинам нежелательна тепловая инактивация:.в случае опредёдения термофильных микроорганизмов, при наличии в пробе низкокипящих примесей и т.д.

Инактивация клеток в присутствии 5 красителей имеет CJ tf«yющиe преимуществ ва перед йнактивацие;й неокрашенн.ых клеток: она более экономична (требуется всего одна суспелзия) и более удобна-дляавтоматизации.10

Способ осуществим для различных .видов мйкроорганиэмов.: представителей энетеробактерий., грамотрицатель.ных а5 робиих хемргетеротрофов, кокков, ацилл, дрожжей. :15

; После инактивации в предложенных режимах клетки всех исследованных микроорганизм.ов сохраняли размер и форму и-поэтому легко были узнаваемы по морфологическим признакам. Количество микроорганизмов, окрашенных предлагаемым способом, можно оп:ределять различными- методами-: све товой и люминесцентной микроскопией, автоматическим счетом на микрофотометре, или микрофлуор.иметре, а т.акже . макрометодами, в частности флуориметрией. ;. л.- ;, . .- ; . - : На фиг. 5 показана калибровочная кривая для .окрашенной примулином сус-. рензи;й клезгрк Е.coll (17-часовая куль-30 vrypa, содержащая практически одни живые клетки) до. и. посзле тепловой инак тивации с регистрацией ф-пуоресценции в кк1Вете на спектрофлуориметре. Инактивация -да,ет -ВОЗМОЖНОСТЬ измерять ко- 35 личество первоначально живых клеток по приросту флуоресценции после инактивации и одределёнйю числа клето.к попрёдварительнс построенной калибров6чн зй кривой. Люминесценция суо- дд пензии .мертвых клеток не увелйчивалась после инактивации

Использовали-культуру следующих . возрастов: Escherichia eoli - 17-часовая, .Bacillus, thuringiensis - 17- « часовая, Sac.charomyces carevisiai .- . 24 часовая.

хШтенсивность люминесценции от отдельных клеток в мазках на предметных стеклах измеряли (вусловных единицах на лк 1инесцентном-микроскопе с помоью фотометрической насадки и выражали в процентах по отнощению .к наивысшей величине, полученной в дайной серии опытов.

Величину оптической плотности вы- 55 числяют по Формуле , гд 1 - интенсивность падающего еве.та; I - интенсивность света, прошедшего через клетку.;1д и I измеряют на микроскопе МЛ- 2 с помощхгю фототермической на-60 садки при освещении црепарата мазка снизу красным светом, Величину оптичесно й плотности выражают в процентах по отношению к наивысшей величине, полученной в данной серии опытов

На фиг. 1 показана Зёшксиморть тепени окраски клеток к{ асителями . т температуры при тепловой инактиваии: 1) E.coli 4: примулин; 2} Вас. hurinqiensis tj примулин 3) Sacch., erevisiae +. метиленрвый синий; ) Sacch. cerevisiae + тиазинрвый расный. ...-..Время тепловой инактивации - 2 мин

По оси ординат - процент устреденной интенсивности. люминес1з;ейции отельных клеток jp случае флрурйхромов, илй ус редненной в еличины рптичёскШ, плотности в случае не иленовогр.сияв-. го..;. . , -...По оси абсцисс - температура ина стивации. : /

На фиг, 2 - зависимость степени окраски клеток красителями от време ни .тепловой инактивации. 1). ,coli +: примулин; 2 Вас, thuringiensis + примулин| 3) Sacch, cereyisi. . тиленовьйй синий; 4) Sacch,: cerevi siae..+ тиазиновый красный.

Температура инактивации в случае Вас,- tharingiensis. - 8)°Сг в р гтальных случаях - , . - -.

nt оси ординат - то же, что и . н|1

фиг. 1 . .,. ;. : - .

По ОСИ абсцисс - время инактивацй.и

ja минутах..

.нафиг.З - зависимость бтепейи-ок раски клеток красителями от койцентрйции фенола при инактивации: 1)Б«со11Ф . римулин; 2) Вас. thuringlensig . примулин; 3) Sacch. Qereviglae МЭ тиленовый синий. .. .

. Пр оси ррдаинат - то же,, что и на фиг, 1.. . ; : . по оси абсцисс - концентрация фенола в процентах. . .

Возраст клеток - как на фиг. 1,

На фиг. 4 - зависимость степени окраски клеток красцтелямв рг Bpeneiни инактивации фенолоь : 1) E.coli + примулин; 2) Вас. thuriiigiensils + принулин; 3) Sacch. cereviaiae - Летиленовый синий.

Концентрация фенола в случае дрржжёй - 10%/ в остальных случаях - 7%,

По оси ррдинат - то же, чтр и н;а фиг. 1..

По оси абсцисс -.время инактивации в минутах. . .

Возраст клеток - как на фиг. 1.

На фиг. 5 - зависимость флурресценции суспензии 1 -часовой культуры E.coli, окрашенной примулшк 4, от концентрации клеток, до и после инактивации: 1} суспензия др инактивацииг 2) суспензия после инактивации при в течение 30 с.

ПР оси ррдинат - интенсивность люминесценции .при нм (Алоэб. « 365.ИМ).

ПР рсиабсцисс 1 общая концентрация клетрк а пррбе «10 кл/мл,

Крвдентрация примулина 30 мхг/ Измерения проводились на спектрег флуориметре Aminco Bowman. Пример, К 1,8мл суспензии клеток В. coli (8-часовая культура), содержащей живые и мертвые клетки, добавляют О,2 мл раствора примулина (1 мг/мл) на 1/15 М фосфатном буфере рН 6,0 - 7,8, через 3 мин готовят Клеточный препарат по Виноградскому, считают число ярко флуоресцирующих мертвых клеток, а оставшуюся суспензию прогре&ают 3 мин при , снова готовят клеточный препарат по Виноградскому, считают общее количество флоуресцирукщих клеток и по разнице между двумя отсчетами находят число живых клеток. Клетки в препаратах просчитывают на люминесцентном микроскопе при возбуждении сверху синефиолетовым светом (объектив 90, окуляр г 1 о). Пример2. К 1,8 мл суспензии 24-часовой культуры Sacch. cerevlsiae содержащей различные соотношения жи- ВЕ0 и мертвых (убитых спиртом) клеток, добавляют 0,2 мл водного раствора мети; енового синего (1 мг/мл) и проводят Операции, как указано в примере 1, за исключением того, что подсчет ведут на светопольном микроско,пе при освещении снизу ,и считают клет ки, ярко окрашенные в синий свет. Приме г 3. К 1,8 мл суспензии клеток 17-часовой культуры Вас. thurlnglensls, содержащей ;н мертвые клетки, добавляют 0,2 мл раствора примулина (1 мг/мл) на 1/15 М фгэофатном буфере рН 6,0-7,8, через 3 мин измеряют число мертвых ярко флуоресцирующих клеток, как указано в примере 1, затем добавляют к суспензии фзнол ввиде концентрированного спиртового раствора до концентрации 7%, измеряют общее число флуоресцирующих клеток, как указано в примере 1, и по разнице между двумя отсчетами находят число живых клеток. . Пример4.К1,8мл суспензии 24-часовой культуры Saccr. cereyisiae/ содержащей различные соотношения живых и мертвых (убитых нагревом) клеток добавляют 0,2 мл водного раствогра тиазинового красного (1 мг/мл), через 3 мин изАеряют число мертвых ярко флуоресцирующих клеток, как указано в примере 1, затем добавляют к измеряют общее число флуоресцируюцих клеток, как указано в примере 1, и по разнице между двумя отсчетами находят число живых клеток. Результаты определения числа живых и мертвых клеток предлагаемым и контрольным способами представлены в таблице.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ в исследуемом образце, предусмвтрк&акядий приготовление суспензии микроорганизмов в водной среде, отличающийс я тем, что, с целью ускорения и упроще НИН способа, суспензию микроорганизмов окрашивсиот красителем на мертвые клетки, ведут..подсчет окрашенный мертвых клеток, затем суспензию инактивируют путем нагрева при 70-100 с в . течение 0,5-5 мин или путем химической обработки, после чего ведут подсчет общего кэличества окрашенных мертвых клеток и по разнице двух пбщсчетов определяют содержание живых клеток в суспензии. (Л С

Окраска примулином, инакти102вация теплом Окраска приму лином, инакти106вация фенолом Окраска метиленовым синим, инактивация теплом

Окраска тиазиновым красным, инактивация этанолом

100 100

1:1 3:1

1:3

1:1

1:1,03 2,93:1,0

3:1

1:3,03

1:3

Таким- образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет | ускорить определение 026 ч до I IlfS 4j а также снизить трудоемкость

J

7

/

.,- I

за счет проведения простых операций, не требующих омывок реактивов и позгволякцих использовать один набор регистрируюдей аппаратуры.

5

ФигЛ

1

/

fS

10

Фаз.