Способ диагностики синдрома гиперкоагуляции Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и коагулоло- гни.

Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа диагностики синдрома гиперкоагуляции.

Способ осуществляют следующим образом.

Из венозной гепаринизированной крови (З-ЗдЗ мл) на градиенте платности фиколл-верографина (,077 г/м ВБщеляют мононуклеарные клетки с чистотой 85-90%. Выделенные клетки трижды отмывают от сывороточньпк; белков средой 199, Доводят до рабочей концентрации 2-3-10 /мл в среде 199 В реак1щи используют эритро1 ;иты быка сенсибилизированные к тромбину„ Их получают следующим образом.

Эритроциты быка отмывают трижды физиологическим раствором. Из отмытых эритроцитов готовят 10%-ную взвесь на физиологическом растворе, К 3,0 мл 10%-ной взвеси эритроцитов быка добавляют 1,0 мл 051%-ного раствора ализаринового красного, приготовленного на физиологическом растворе, и тромбина очищенного,, без плазминогена (10 ед.)5 растворенного в физиологическом растворе (1,0 14л) „ Тщательно перемешивают и ставят в термостат при 45 С на 1 ч. Затем эри трощ1ты быка вновь отмывают трилоды физиологическим раствором и готовят 2%-ную суспензию эритроцитов в физиологическом растворе. В последующем к 0,2 мл лимфоцитов в концентрации 2-3-10 /мл добавляют 0,2 14П 2%-ного раствора эритрогщтов бьпса, сенсибилизированных тромбином. Смесь инкубируют при 37°С 10 мин, затем центрифугируют при 1000 об/мин 5 мин-и выдерживают в холодильнике при 4 С 1 ч или оставляют на ночь (18 ч), Далее подсчитывают количество лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами быка (3 эритроцита и более), на 100 клеток.

Для исключения неспецифического образования розеток ставили параллельно 3 пробы: отмытые эритроциты быка и ЛИМФОЦИТЫ эритроциты быкоц, сенсибилизированные 0,1%-ным раствором ализаринового красного, и лиг фоциты;; эритроциты быка, сенсибилизированные ализариновым красным и нагруженные тромбином, и лимфоциты.

3340852 ,

Обследовано 57 детей, из них 16 здоровых и 41 с OP3s бронхитом из различной формой пневмонии. I- Пример 1 . Проведено исследование здорового ребенка 2 лет

3,0 мл гепаринизированной крови (25 ед/кп) разводят физиологическим раствором в 2 раза и наслаивают на 10 3,0 кп фиколл-верографина (плотность 1j077 г/мл), Центрифугируют 40 мин при 1500 об/мин. Снимают с интерфазной поверхности взвесь лимфоцитов и отмывают средой 199 три раза при

0

5

0

5 1000 об/мин в течение 10 мин затем проверяют жизнеспособность выделения лимфоцитов по суправитальной окраске с трипановым синим и осуществляют подсчет лимфоцитов в 1 ил. Готовят рабочий раствор ( 10 /мл) лимфо- 1ЩТОВ в среде 199. Параллельно с описанной процедурой осуществляют трехкратное отмывание эритроцитов быка,, готовят 10%-ную суспензию в физиологическом растворе, В 3 пробирки разливают по 3,0 мл 10%-ного раствора эритроцитов быка, В 1-ю пробирку добавляют 2,0 мп физиологического раствора, во 2-ю - 1,0 мл 051%-ного раствора ализаринового красного и 15 О мл физиологического раствора5 в 3-ю 1,0 мл 0,1%- ного раствора гшизаринового красного и 1,0 мл тромбина в дозе 10 ед/мл. Тромбин очищенный, без плазминогена. Каунасского производства о Все три пробирки ставят в термостат при 45 С на 1 4t Затем трижды отмывают эритроциты и готовят 2%-ную суспензию на физиологическом растворе,, Ставят параллельно 3 пробы, ДЛЯ чего в 3 пробирки разл 1вают по 0,2 мп суспензии лимфоцитов и соответственно добавляют по О,, 2 МП приготовленных предварительно эритроцитов быка. Пробы тщательно перемешивают и ставят в термостат при 37 С на 10 мин, затем иентрифугир: ют при 1000 об/мин 10 мин и инкубируют при в течение 18 ч. После инкубации все три пробы ресус- п.ензируют и подсчитывают количество ЛИМФОЦИТОВ; образовавших розетки не менее чем с тремя эритроцитами быка,

В 1-й пробирке розеток не обнаружено., во второй Т41кже нет розеток, в третьей выявггены 2 розеткообразую- шие клетки (из 100), к которым в одном случае прксоеди жпись 4 эритроцита быка, возле другой клетки образовалась полуморула,

0 i

5

5

313

Для идентификации лимфоцитов про- ведеио дополнительное исследование с помощью люминесцентной микроскопии Подтверждено наличие лимфоцита в центре розетки зеленым свечением ядра.

Таким образом, показана возможность наличия рецепторов к тромбину на лимфоцитах у здорового ребенка. Всего обследовано 16 здоровых детей; средяя величина содержания розеток - 1,1±0,2.

Пример 2. Ребенок Ч., бмес. Диагноз: острая двухсторонняя очаговая пневмония, острый период. 3,0 мл гепаринизированной крови (25 ед/мп) разводят физиологическим раствором в

15

Пример 3. Ребенок И, 1г. 4 мес. Диагноз: двухсторонняя пневмония, справа полисегментарная, i-ir l Лимфоциты сенсибилизированные тромбином эритроцитов быка, получают аналогично описанному в примере 1. Количество лик оцитов, обра2 раза и наслаивают на 3,0 мл фиколл- 20 зовавших розетки - 14, что свидетель35

верографина (плотность раствора 1,077 г/мп). Последующая процедура выделения клеток и постановка проб аналогичны описанным в примере 1. В 1-й npo6jipKe розеток не обнаружено. 25 во 2-й - 2 розетки, в 3-й - 9 розеток. К лимфоцитам прикрепилось от 3 до 10 эритроцитов быка. Следовательно, в острый период пневмонии экспрессия рецепторов к тромбину более 30 выражена, что обусловлено активацией свертывающей системы, большим содержанием тромбина в кровотоке и возможной сенсибилизацией лимфоцитов, это свидетельствует о наличии у больного синдрома гиперкоагуляции. Для подтверждейия этого известными дами необходимо провести ряд исследований: определение тромботеста; определение времени рекальцификации; определение содержания фибриногена; определение тромбинового времени; определение протромбинового индекса запись тромбоэластрограммы. Проведенные исследования показали, что время рекальцификации составляло 115 с; концентрация фибриногена 340 мг %; тромбиновое время 23 сj протромбиновый индекс 97%. Данные тромбоэластограммы: Р - 4 мин, 30 ; К - 2 мин; мА - 50 мм. Только по одному из проведенных исследований судить о состоянии системы гемостаза не представляется возможным. Анализ коагулограммы (совокупности иссле- 55 дований) свидетельствует о тенденции к гиперкоагуляции, т.е. для обоснования данного вьшода необходимо было провести шесть исследований.

ствует о значительной концентрации в периферическом кровотоке тромбина и, следовательно, о более выраженной гиперкоагуляции по сравнению с примером 2. Это связано с более тяжелым и распространенным процессом в легких. Проведенные рутинные исследования системы гемостаза также свидетельствовали о значительно выраженном ги- перкоагуляционном синдроме. Так, время свертывания крови по Ли-Уайту составляло 3 мин, время рекальцификации 85, степень тромботеста VI, тромбиновое время 19; протромбиновый индекс 95%j фибриноген 308 мг %.

Следовательно, по предлагаемому способу можно дать интегральную оценку состояния гемостаза в данный момент, не прибегая к многочисленным рутинным методам исследования. . :

Всего обследован 41 больной, причем среднее содержание розеток при пневмонии составило 8,2±1,1.

Способ прост, не требует дорого- сто;ящего оборудования и реактивов и может быть осуществлен, в любой лаборатории клинической иммунологии.

45

50

Формула изобретения

Способ диагностики синдрома гиперкоагуляции у детей, больных острой пневмонией, путем исследования крови, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, из исследуемой периферической крови выделяют лимфоциты, определяют в реакции розетко

Таким обраяом, предлагаемый способ упрощает диагностику гиперкоагуляции. Поскольку способ отражает экспрессию рецепторов лимфоцитов к тромбину, то он обеспечивает повышение точности диагностики, так как отражает уровень циркулирующего в периферической крови фермента тромбина, который -является ключевым в системе гемостаза, и его содержание увеличивается при гиперкоагуляции.

Пример 3. Ребенок И, 1г. 4 мес. Диагноз: двухсторонняя пневмония, справа полисегментарная, i-ir l Лимфоциты сенсибилизированные тромбином эритроцитов быка, получают аналогично описанному в примере 1. Количество лик оцитов, обра

ствует о значительной концентрации в периферическом кровотоке тромбина и, следовательно, о более выраженной гиперкоагуляции по сравнению с примером 2. Это связано с более тяжелым и распространенным процессом в легких. Проведенные рутинные исследования системы гемостаза также свидетельствовали о значительно выраженном ги- перкоагуляционном синдроме. Так, время свертывания крови по Ли-Уайту составляло 3 мин, время рекальцификации 85, степень тромботеста VI, тромбиновое время 19; протромбиновый индекс 95%j фибриноген 308 мг %.

25 30 55

Следовательно, по предлагаемому способу можно дать интегральную оцеку состояния гемостаза в данный момент, не прибегая к многочисленным рутинным методам исследования. . :

Всего обследован 41 больной, причем среднее содержание розеток при пневмонии составило 8,2±1,1.

Способ прост, не требует дорого- сто;ящего оборудования и реактивов и может быть осуществлен, в любой лаборатории клинической иммунологии.

45

25 30 55

50

Формула изобретения

Способ диагностики синдрома гиперкоагуляции у детей, больных острой пневмонией, путем исследования крови, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности способа, из исследуемой периферической крови выделяют лимфоциты, определяют в реакции розетко513340858

хэбразования количество клеток, несу держании их более 2% диагностируют щих рецепторы к тромбину, и при синдром гиперкоагуляции.

Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - упрощение и повышение точности способа. Из венозной гепаринизированной крови выделяют мононуклеарные .клетки и отмывают их. К лимфоцитам добавляют эритроциты быка, сенсибилизированные к тромбину. Смесь инкубируют, центрифугируют и вьщерживают в холодильнике. .Подсчитывают ксхпичество лимфоцитов, образовавпшх розетки с эритроцитами быка, на 100 клеток. При содержании их более 2% диагностируют синдром гиперкоагуляции. Для идентификации лимфоцитов проводят дополнительно люминесцентную микроскопию. 00 со 4 о X