Способ определения динамики таксиса микроорганизмов Советский патент 1987 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано .для определения динамики таксиса микроорганизмов в применении к биотехно„ „

логии, сельскохозяйственной микробиологии, а также к медицинским исследованиям.

Цель изобретения - повышение точности определения таксиса,

На фиг, показана кювета с нанесенным на боковые стенки гелем, продольный разрез; на фиг,2 - зависимость оптической плотности от времени для суспензии клеток Azospirillum brasilense в контрольном опыте (1) и в градиенте D-фруктозы при ее начальной концентрации 10 м (II); на фиг.З зависимость концентрации сухих веществ клеток от времени для суспензии клеток Azospirillum brasilense в контрольном опыте (1) ив градиенте фруктозы при его начальной концентрации (II).

Кювета содержит боковые (нерабочи стенки 1, на которые нанесены слои 2 геля, зону 3 светового пучка, дно

В предлагаемом способе создают двусторонний горизонтальный градиент Преимущество двустороннего горизон- тального градиента перед одностороц- ним вертикальным заключается в том, что вертикальный градиент совпадает по направлению с градиентом кислород образующимся в кювете. Поскольку по- давляющее большинство микроорганизмо проявляют таксис не только на химичекие раздражители, но и на кислород, ориентация клеток в вертикальном градиенте может быть вызвана реакцией не на раздражитель, а на кислород. В предлагаемом способе создаваемый градиент является горизонтальным и не совпадает по направлению с градиетом кислорода. Фактически в кювете создаются два градиента одинаковые по составу и концентрации, но противоположные по направлению (оба градиента направлены в центр кюветы), что повышает точность определения таксиса, путем снижения вероятности ошибки.

Кроме того, в предлагаемом способе определения динамики таксиса микроорганизмов определяют скорость перемещения клеток под влиянием раздражителя по концентрации сухих веществ клеток, получаемой спектротурб диметрически.

Изменение скорости премещения клеток через изменение их концентрации можно проводить любыми оптическими измерениями, позволяющими, в принципе, получить такую информацию: фотометрическими, нефелометрическими, спектротурбидиметрическими. Последние измерения являются более точным, но не обязательным элементом,

Способ осуществляется следующим образом,

Динамику таксиса регистрируют с помощью спектрофотометра, В эксперименте используют контрольную кювету и ряд опытных для исследования различных концентраций раздражителя. Сначала готовят контрольную кювету. На боковые нерабочие внутренние стенки кюветы наносят ровный слой нетоксичного для микроорганизмов геля. Например, гель можно наносить в расплавленном состоянии с помощью пипетки или автоматического дозатора. Для этого кювету -помещают горизонтально на боковую поверхность, наносят жид- к.ий гель, а после затвердения .геля; кювету переворачивают и такое же количество геля на противоположную стенку кюветы. Объем наносимого геля подбирают так, что он покрывает ровным слоем всю поверхность боковой стенки кюветы, но слои геля не перекрывают световой пучок, проходящий через кювету (фиг,1).

После затвердевания геля на боковых стенках кювету заполняют .суспензией микроорганизмов с оптической плоностью, соответствующей режиму работы спектрофотометра (0,3-0,6), облучают лучом фотометрической системы спектрофотометра, проводят измерение оптической плотности в зависимости от времени. Учитывая, что изменение оптической плотности прямо пропорционально изменению концентрации микроорганизмов, строят график зависимости оптической плотности от времени и по этому графику определяют относительную скорость перемещения микроорганизмов (как тангенс угла наклона касательной к оси абсцисс). Определенная, таким образом, скорость перемещения микроорганизмов в контрольной кювете является постоянной и вызвана только седиментацией клеток,

Далее проводят измерения в опытной кювете. Подготовка кюветы к эксперименту и методика измерений отличается

от контроля только тем, что перед нанесением геля на боковые стенки кюветы в него вводят исследуемый раздражитель. Все остальные процедуры остаются неизменными. Проводят измер.е-- НИН для всех имеющихся концентраций .раздражителя. Поскольку в опытах соблюдены все те же операции, что и в контроле, за исключением добавле- НИН раздражителя, изменение скорости перемещения микроорганизмов по сравнению с контролем являeтciя однозначной характеристикой таксиса.

Способ основан на способности мик- роорганизмов перемещаться по направлению к возрастающей концентрации положительного раздражителя (аттрактан- та) и от убывающей концентрации отрицательного раздражителя (репеллента), Если на боковые стенки кюветы наносится гель (твердая среда) с раздражите- лем, а сами кювеТы заполняются суспензией микроорганизмов, раздражитель , диффундирует из твердой среды (гель) в жидкую (суспензию), причем его градиент направлен от боковых стенок к центру кюветы, т.е. к зоне светового пучка. Если раздражитель является аттрактантом, микроорганизмы переме- щаются из центра кюветы в обе стороны к боковым стенкам (в сторону возрастающей концентрации) и выходят из зоны светового пучка, что регистрируется прибором. Если раздражитель является репеллентом, микроорганизмы перемещаются в Сторону убывающей концентрации, т.е. от боковых стенок к центру - в зону светового пучка. Прибор регистрирует увеличе- ние численности микроорганизмов.

V

Наилучшие результаты получают, если перемещение клеток определять по концентрации сухих веществ клеток, определяемой спектротурбидиметрически Для этого, измеряют значения оптичес- кой плотности не при фиксированном значении длины волны, а при пяти значениях длин волн (4(30,450,500,550 и 600 нм). Далее производят расчет спектротурбидиметрических данных, например, с помощью мини- или микро-ЭВМ. Рассчитанная концентрация сухих веществ клеток является одно-, значной характеристикой концентрации клеток, по изменению которой с максимальной точностью судят о скорости перемещения клеток.

Пример. Определяется наличие хемотаксиса у бактерий Azospirillum brasilense sp 7, На фиг.2 приведены графики зависимости оптической плотности от времени для суспензии бактерий в градиенте фруктозы. Концентрация фруктозы в геле составляет 10 м. На фиг.З приведены графики зависимости концентрации сухих веществ клеток от времени для тех же условий эксперимента. Как следует из приведенных графиков, скорость перемещения клеток, определенная через изменение оптической плотности как тангенс угла наклона касательной к оси абсцисс, составляет в контроле 2,5 , а в опыте 2 -10 мин Таким образом, скорость перемещения клеток в градиете фруктозы увеличивается в 8 раз. Скорость перемещения клеток, определенная через изменение концентрации сухих веществ клеток (также, как тангенс угла наклона касательной к оси абсцисс), составляет в контроле 5 10 г/см -мин , а в опыте 5-Ш гУсм -мин , т.е. в градиенте фруктозы скорость перемещения клеток увеличивается в 10 раз.

Из указанного следует, что хемотаксис у исследуеь{ых бактерий Azospirillum brasilense есть формы кривых изменения оптической плотности и концентрации сухих веществ клеток в контроле и в опыте существенно отличаются, скорость перемещения клеток в градиенте раздражителя в несколько раз выше, чем в контроле, скорость перемещения клеток, выраженная через изменение концентрации сухих веществ клеток, более точный критерий, чем скорость,выраженная через изменение оптической плотности.

Способ не сложен в эксплуатации, осуществим в условиях любой микробиологической и биохимической лаборатории, поскольку не требует сложного, дорогостоящего и дефицитного оборудования. При условиях осуществления способ обладает высокой точностью, поскольку отсутствует визуальная оценка параметров. Повышение точности следует понимать в двух аспектах: в предлагаемом способе реализуются условия для определения динамики перемещения Микроорганизмов и для количественной характеристики используются спектро- турбидиметрические измерения, более точные, чем простые измерения, оптической плотности или рассеяния при одной длине волны света,,Способ не вызывает сложности в его внедрении, реализуется с помощью серийных спектрофотометров и мини- или микро-ЭВМ,

Фор м.у л а и 3 о бретения Способ определения динамики такчающийся тем, что., с целью повышения точности определения таксиса, градиент раздражителя создают горизонтальным с двух сторон по направлению к световому пучку, проходящему через суспензию микроорганизмов, путем нанесения на боковые нерабочие стенки кюветы слоя геля, не перекрываюсиса микроорганизмов, включающий соз- . ще го пучок света и содержащего р а здражидание градиента раздражителя в суспен-- зии микроорганизмов и фотометр1фова- ние света, прощедшего через суспензию микроорганизмов, помещенную в кювету спектрофотометра, о т п и

15

таль, затем определяют скорость перемещения клеток по изменению их концентрации и о динамике таксиса судят по полученным значениям скорости перемещения клеток ,

чающийся тем, что., с целью повышения точности определения таксиса, градиент раздражителя создают горизонтальным с двух сторон по направлению к световому пучку, проходящему через суспензию микроорганизмов, путем нанесения на боковые нерабочие стенки кюветы слоя геля, не перекрываю ще го пучок света и содержащего р а здражи

таль, затем определяют скорость перемещения клеток по изменению их концентрации и о динамике таксиса судят по полученным значениям скорости перемещения клеток ,

1

l.f

i/

К

5« I

S

Х

IPuf.f

to Фиг.г

ю ч

Время, мин Фиг$

го

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения динамики таксиса микроорганизмов в применении к биотехнологии, сельскохозяйственной микробиологии и медицинским исследованиям. Целью изобретения является повышение точности определения таксиса микроорганизмов. Способ заключается .в том, что суспензии микроорганизмов, помещенных в кювету спектрофотометра, создают горизонтальный градиент раздражителя путем нанесения на боковые нерабочие стенки кюветы слоя геля, не перекрывающего световой пучок и содержащего раздражитель, затем фо- тометрируют свет, проходящий через суспензию, определяют значения скорости перемещений микроорганизмов по изменению их концентрации и о динамике таксиса судят по полученным значениям скорости перемещения. Наилучшие результаты получаются при спект- ротурбидиметрическом определении концентрации микроорганизмов, 3 ил. Ш (Л со со ел ел 05 Oi

Редактор И,Горная

Составитель О,Борисова

Техред В.Кадар Корректор А.Обручар

Заказ 4018/22Тираж 499Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4