Биологический агент для стимуляции ростовых процессов в растениях Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, касается биологических средств для стимуляции роста растений и повышения их продуктивности и представляет собой один из аспектов применения бактерии Azospirillum zeae штамма OPN-14, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером В-12542. Благодаря выраженной рост-стимулирующей активности, устойчивости к некоторым химическим пестицидам и способности длительное время сохранять жизнеспособность и биологическую активность при хранении в виде жидкой культуры, штамм может быть использован в качестве основы микробиологического препарата со свойствами регулятора роста и биоудобрения.

При использовании микроорганизмов в качестве средств для обработки сельскохозяйственных культур конечной целью является повышение продуктивности растений и улучшение качества получаемой продукции. В связи с этим при скрининге микробиологических агентов наличие у них способности стимулировать рост растений оказывается одним из важнейших критериев для оценки перспективности их применения, поскольку именно стимуляция роста является интегральным показателем эффективности комплексной «полезной» биологической активности микроорганизма.

Принято считать, что усиление роста растений при воздействии микроорганизмов в основном происходит благодаря продукции последними стимулирующих веществ, таких как фитогормоны, и улучшению минерального питания растений за счет фиксации молекулярного азота и повышения доступности для растений элементов питания, находящихся в почве. Кроме того, уменьшение стрессовой нагрузки на растения, в том числе, снижение заболеваемости, повышение устойчивости к неблагоприятным воздействиям, деградация токсичных веществ в среде обитания под влиянием микроорганизмов также косвенно способствует лучшему росту и большей продуктивности.

Предложено и запатентовано множество различных штаммов микроорганизмов для использования в производстве биопрепаратов в качестве основных действующих агентов. Однако большинство работ посвящено созданию решений для защиты растений от фитопатогенов, и гораздо меньшее внимание уделяется микроорганизмам, для которых более хорошо выраженной является непосредственная рост-стимулирующая активность.

Известны штаммы микроорганизмов, непосредственно стимулирующие рост и способствующие повышению продуктивности растений, такие как Pseudomonas putida ВКПМ В-4308 (Патент РФ №2051586, опубл. 10.01.1996), Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615 (Патент РФ №2121271, опубл. 10.11.1998), Streptomyces chrysomallus Р-21 (Патент РФ №2226214, опубл. 27.03.2004), Bacillus subtilis 8А (Патент РФ №2495119, опубл. 10.10.2013), Serratia ficaria ВКПМ В-11403 (Патент РФ №2545398, опубл. 27.03.2015), Bacillus pumilus А1.5 (Патент РФ №2551968, опубл. 10.06.2015), Bacillus atrophaeus ВКПМ В-11474 (Патент РФ №2570624, опубл. 10.12.2015), Bacillus cereus 875 TS (Патент РФ №2624032, опубл. 30.06.2017). Однако ни для одного из перечисленных штаммов не указаны возможные механизмы прямой стимуляции роста растений, что не позволяет делать уверенные прогнозы относительно эффективности их применения в различных условиях и на различных культурах.

Известен штамм дрожжей Exophiala nigrum А-26 (Патент РФ №2103872, опубл. 10.02.1998), стимулирующий рост растений за счет продукции фитогормонов цитокининов и индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Известен штамм бактерий Azotobacter vinelandii ИБ-1 (Патент РФ №2224791, опубл. 27.02.2004), который стимулирует рост растений за счет продуцирования гормонов роста - цитокининов. Известен штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 (Патент РФ №2295562, опубл. 20.03.2007), обладающий способностью фиксировать молекулярный азот, что должно способствовать улучшению минерального питания растений и обеспечивать их лучший рост. Известен штамм Pseudomonas putida ВКМ В-1743Д (Патент СССР №1805849), для которого механизмом прямой стимуляции роста растений является способность штамма растворять минеральные фосфаты, в частности, гидроксилапатит. Известен штамм бактерий Bacillus mucilaginosus ВКПМ В-5987 для получения бактериального удобрения и экзополимера (Патент РФ №2081867, опубл. 20.06.1997), обладающий не только способностью растворять труднодоступные соединения фосфора, но и увеличивать содержание фосфора в биомассе растений. Известен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 (Патент РФ №2289621, опубл. 20.12.2006), совместимый с некоторыми химическими пестицидами и способный трансформировать нерастворимые соединения фосфора и калия, что должно способствовать улучшению минерального питания растений и обеспечивать их лучший рост. Известны фосфатрастворяющие штаммы Acinetobacter species ГКПМ-Оболенск В-6645 (Патент РФ №2451068, опубл. 20.05.2012) и Pseudomonas species ГКПМ-Оболенск В-6646 (Патент РФ №2451069, опубл. 20.05.2012), проявляющие высокую фосфат-мобилизующую активность.

Общим недостатков описанных изобретений является то, что у микроорганизмов выявлен лишь один механизм прямой стимуляции роста, что ограничивает их применение в качестве стимуляторов роста растений.

Известен штамм Bacillus megaterium ВКМ В-2357Д (Патент РФ №2327737, опубл. 27.06.2008), мобилизующий фосфор и кремний из объектов литосферы, устойчивый к полигексаметиленгуанидину, продуцирующий ИУК и гиббереллины.

Известен штамм бактерий Paenibacillus sp. ВКМ В-2823Д (Патент РФ №2539738, опубл. 27.01.2015), продуцирующий цитокинины, способный к переводу малорастворимых фосфатов в растворимые формы и обладающий нитрогеназной активностью.

Однако авторами не приведены какие-либо сведения о влиянии этих бактерий на рост и продуктивность растений.

Известна ассоциация штаммов бактерий Bacillus subtilis K-4, Bacillus subtilis Ве-12, Bacillus amyloliquefaciens 30-40 (Патент РФ №2314693, опубл. 20.01.2008), в которой штамм В. amyloliquefaciens 30-40 проявляет азотфиксирующую активность, а штамм В. subtilis Ве-12 переводит нерастворимые соединения фосфорной кислоты в растворенное состояние. Однако ничего неизвестно о способности этих двух штаммов стимулировать рост растений по-отдельности, а также о стабильности ассоциации в естественных условиях.

Известен биопрепарат для стимуляции роста и защиты растений от болезней, повышения урожайности и почвенного плодородия на основе штамма Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 (Патент РФ №2478290, опубл. 10.04.13). Рост-стимулирующий эффект обеспечивается способностью к растворению малорастворимых фосфорсодержащих веществ в почве и способностью фиксировать атмосферный азот.

Известен штамм Pseudomonas azotoformans F30A (Патент РФ №2550268, опубл. 10.05.2015) для улучшения всхожести и роста растений, который проявляет способность фиксировать молекулярный азот, мобилизовать труднорастворимые соединения фосфора, повышать доступность для растений соединений серы.

Известен штамм бактерий Bacillus megaterium 501 GR, применяемый в качестве полифункционального средства для растениеводства, обладающего одновременно ростостимулирующим эффектом, улучшающего фосфорное питание растений, способствующего повышению их продуктивности, защиты растений от корневых грибных болезней, а также способствующего биоремедиации загрязненных пестицидами почв (Патент РФ №2558291, опубл. 27.07.2015).

Однако в описанных случаях прямая стимуляция роста растений при воздействии бактерий обеспечивается только улучшением минерального питания, что ограничивает возможности применения штаммов.

Известен штамм бактерий Azotobacter vinelandii ИБ 4 для получения биопрепарата для борьбы с корневыми гнилями пшеницы и повышения количества и качества урожая (Патент РФ №2245918, опубл. 10.02.2005), которое обусловлено наличием у штамма достаточно высокой нитрогеназной активности и продукцией цитокининов.

Известен штамм Azotobacter chroococcum ВКПМ В-9029, устойчивый к действию некоторых пестицидов, используемый для получения биологического препарата, предназначенного для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур и повышения их устойчивости к различным заболеваниям (Патент РФ №2289620, опубл. 20.12.2006). Штамм обладает нитрогеназной активностью и продуцирует ИУК.

Известен штамм Sphingobacterium multivorum ВКПМ В-103 85, используемый для получения бактериального удобрения под томаты и огурцы (Патент РФ, №2458119, опубл. 10.08.2012). Штамм синтезирует ИУК, витамины, проявляет нитрогеназную активность, что способствует повышению продуктивности растений.

Известен штамм азотфиксирующих бактерий Pseudomonas sp. ИБ-4 для получения препарата против заболеваний пшеницы и повышения урожайности (Патент РФ №2529958, опубл. 10.10.2014). Штамм обладает высокой ростстимулирующей активностью за счет фиксации молекулярного азота и продукции цитокининов.

Общим недостатком указанных изобретений является малый спектр растений, отзывчивых на обработку описанными микроорганизмами.

Из уровня техники известен штамм Azospirillum zeae OPN-14, являющийся основой препарата Органит Н благодаря своей способности к фиксации атмосферного азота (Пожарский В.Г., Боканча И.Н., 2016). Однако более детальное исследование свойств штамма позволило нам обнаружить у него ярко выраженную рост-стимулирующую активность, а также такие важные свойства, как устойчивость к ряду химических пестицидов и сохранение жизнеспособности и биологической активности при длительном хранении в виде жидкой культуры, что существенно расширяет возможности практического применения этого микроорганизма.

Задачей заявленного изобретения является расширение возможностей применения природного штамма Azospirillum zeae OPN-14, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером В-12542, за счет его использования в качестве активного стимулятора ростовых процессов в растениях.

Эта задача решается благодаря выявлению у этого микроорганизма способности стимулировать рост растений и повышать их продуктивность, важным механизмом реализации которой является проявление штаммом фитогормон-подобной активности. С точки зрения практического использования существенными свойствами этой бактерии также являются устойчивость к ряду химических пестицидов и, следовательно, возможность применения в составе баковых смесей с этими препаратами, и сохранение жизнеспособности и рост-стимулирующей активности при длительном хранении жидкой культуры.

Штамм Azospirillum zeae OPN-14 был выделен нами с поверхности корней кукурузы. Видовая принадлежность культуры была определена на основании результатов секвенирования гена 16S рРНК во ФГУП ГосНИИГенетика. Он имеет следующие характеристики.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки представляют собой короткие прямые палочки, по Граму окрашиваются отрицательно. Обладают характерным винтообразным движением. Внутри клеток накапливаются гранулы поли-β-гидроксибутирата.

На среде АТСС 838 (состав, г/л: KH₂PO₄ - 0,4; K₂HPO₄ - 0,1; MgSO₄⋅7H₂O - 0,2; NaCl - 0,1; СаС1₂ - 0,02; FeCl₃ - 0,01; Na₂MoO₄⋅2H₂O - 0,002; малат натрия - 5,0; дрожжевой экстракт - 0,05; глюкоза - 5,0; агар бактериологический - 20,0; вода дистиллированная - до 1 л; рН 7,0) через 48 часов после посева образует округлые выпуклые глянцевые прозрачные бесцветные колонии с ровным краем без выделенного центра диаметром 1-2 мм.

На картофельном агаре (КА, состав: отвар из 200 г очищенного картофеля объемом 1 л, полученный на водопроводной воде, с добавлением 20 г агара; рН 7,0) через тот же промежуток времени формирует округлые, слабо выпуклые полупрозрачные колонии с ровным или фестончатым краем без выделенного центра диаметром 2-8 мм, имеющие слабый розоватый оттенок. Со временем колонии становятся непрозрачными, а розовый цвет - более выраженным.

При инкубации на среде с конго красным аккумулирует краситель с образованием через 2 суток плотных, непрозрачных, мелких (около 1 мм в диаметре) ярко алых колоний.

Физиолого-биохимические свойства:

Микроаэрофил. На полужидких средах в подповерхностном слое образует характерное кольцо.

Растет в диапазоне температур от +15 до 39°С с оптимумом 30°С. Способен расти на среде с 1% желчи, но не с 3% NaCl.

Продуцирует оксидазу, каталазу, уреазу, фосфатазу, L-аспарагиназу. Индол и флуоресцирующие пигменты не образует. Осуществляет редукцию нитратов до нитритов и свободного азота. Хорошо растет на органических кислотах. В качестве единственного источника углерода и энергии использует сукцинат, малат, лактат, пируват, глюконат, цитрат, глицерин, маннит, сорбит, глюкозу, фруктозу, галактозу, арабинозу и рибозу. Гидролизует эскулин, но не желатину и крахмал. Ферментирует глюкозу и фруктозу в анаэробных условиях.

Штамм A. zeae OPN-14 способен фиксировать атмосферный азот, о чем свидетельствует нитрогеназная активность, выявляемая ацетиленовым методом (Mehnaz, S., Lazarovits, G., 2006). Активность этого фермента при росте на бактерий на среде АТСС 838 составляет 1269±65 нМ С₂Н₄/ч × мг сухой клеточной биомассы.

Штамм хранится при 3-8°С в пробирках под ватно-марлевыми пробками со скошенным КА или средой АТСС 838 под вазелиновым маслом, которое наливается в пробирки по истечении трех-четырех суток роста культуры. В таких условиях срок хранения штамма без пересева составляет не менее 6 месяцев. Для многолетнего хранения (не менее трех лет) клетки штамма подвергают глубокой заморозке, до -85°С; в качестве питательных сред при этом используют картофельный отвар или среду АТСС 838 с добавлением глицерина в количестве 15-20%.

В качестве сред для размножения используют картофельный агар, модифицированную среду АТСС 838, питательный агар (состав, г/л: пептон ферментативный - 20,0; хлорид натрия - 5,0, агар - 20,0; вода водопроводная - до 1 л; рН 7,0); среду TY (состав, г/л: триптон - 6,0; дрожжевой экстракт -3,0; хлорид кальция - 0,38; агар - 20,0; вода дистиллированная - до 1 л; рН 7,0)

Для ферментации в качестве питательной среды используют картофельный отвар. Время культивирования в ферментере составляет 36-48 часов. Количество КОЕ составляет 1-2×10⁹ в 1 мл.

Исследование патогенности заявляемого штамма для теплокровных животных были проведены в ГБОУ ВПО Башкирском государственном медицинском университете, в результате которых было получено заключение о том, что по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности штамм A. zeae OPN-14 не патогенен для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Эффективность штамма в качестве биологического агента с ярко выраженной рост-стимулирующей активностью по отношению к растениям определяется в значительной степени наличием у него фитогормон-подобной активности.

Изменение содержания фитогормонов в растительных тканях представляется одним из наиболее действенных механизмов стимуляции роста растений микроорганизмами. В первую очередь следует отметить, что способность микроорганизмов синтезировать классические стимуляторы роста растений, такие как ауксины, цитокинины и гиббереллины, хорошо известна. Так, при глубинном культивировании A. zeae OPN-14 в культуральной жидкости происходит накопление индольных соединений, выявляемых колориметрическим методом с помощью реагента Сальковского, в количестве от 32 до 46 мкг/мл в зависимости от состава питательной среды и титра культуры.

Для более достоверной оценки вклада фитогормонов в процессы взаимодействия A. zeae OPN-14 с растениями нами были проведены биотесты, которые по возникновению (развитию) специфической физиологической реакции у целых растений или их частей позволяют судить о наличии/отсутствии и степени проявления у тестируемого микроорганизма, вещества и т.п. фитогормон-подобной активности. Для сравнения используют две группы контрольных растений (их частей): обрабатываемые водой и целевым фитогормоном. Для проведения испытаний A. zeae OPN-14 выращивали на картофельном отваре до достижения культурой титра 1-2×10⁹ КОЕ/мл.

Определение ауксин-подобной активности. В основу биотеста положена стимуляция ауксинами растяжения колеоптилей злаков, в частности, пшеницы. Семена пшеницы замачивали в течение 18 ч в водопроводной воде, после чего высаживали в кюветы и помещали в темноту в термостат при 25°С на 2 суток. Для биотеста отбирали проростки с длиной колеоптиля 18-20 мм. Колеоптили отделяли, удаляли первый лист и помещали на миллиметровку (масштабно-координатную чертежную бумагу) так, чтобы отсекаемая зона (5 мм) была ниже апекса на 4 мм, после чего вырезали нужные участки острым лезвием. Получившиеся полые цилиндрики временно помещали в чашку Петри с дистиллированной водой (не более чем на 3 ч). После этого 10 отрезков колеоптилей помещали в чашки Петри диаметром 3 см с 3 мл исследуемых растворов. В качестве контроля использовали дистиллированную воду и раствор ИУК в концентрации 10 мг/л. Чашки Петри помещали в темноту в термостат при 25°С на 18-20 часов, после чего измеряли длину колеоптилей. Результаты представлены в таблице 1.

Согласно приведенным данным, культура A zeae OPN-14 при разведении в 10 раз проявляет стимулирующую активность, подобную и сопоставимую с воздействием ИУК. Концентрированная культура ингибировала рост растяжением, в то время как разбавленная в 100 раз - все еще стимулировала рост, хотя и в меньшей степени. Эти данные укладываются в рамки представлений о сильной зависимости тех или иных эффектов фитогормонов от их концентрации.

Определение цитокинин-подобной активности. В основе биотеста лежит способность цитокининов задерживать пожелтение срезанных листьев. О действии цитокининов на листья судят по содержанию в них хлорофилла, которое коррелирует с содержанием белка и отражает общее состояние листьев.

Растения ячменя выращивали в нестерильной почве в кюветах на светоплощадке. Когда первый лист после появления всходов достигал максимального размера (около 14 дней) его срезали и, отступив 2 см от основания листовой пластинки, отсекали фрагмент длиной 2 см. В чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную 3 мл исследуемых растворов, раскладывали по 9 отрезков. В качестве контрольных растворов использовали дистиллированную воду и раствор 6-бензиламинопурина (БАП) в концентрации 10 мг/л. Чашки Петри с отрезками листьев помещали в кюветы, на дно которых наливали воду, и закрывали сверху стеклом для поддержания оптимальной влажности. Кюветы ставили под люминесцентные лампы на круглосуточный свет (25000 люкс) на 7 дней.

Для определения содержания хлорофилла по три отрезка из одной и той же чашки взвешивали, помещали на 1 час в морозильную камеру, после чего заливали 80%-ным этанолом из расчета 1:30, закрывали пробками и оставляли на 7 дней в темноте для экстракции хлорофилла. После этого определяли оптическую плотность полученных вытяжек при длине волны 650 нм; по полученным данным судили о сохранности хлорофилла в отрезках листьев опытных растений по сравнению с контролем. Результаты приведены в таблице 2.

Таким образом, можно сделать вывод, что A. zeae OPN-14 проявляет высокую цитокинин-подобную активность.

Определение гиббереллин-подобной активности. Биотест проводили на гипокотилях проросших семян салата сорта Берлинский желтый. Семена салата проращивали в течение суток при комнатной температуре и постоянном освещении, а затем двое суток в термостате при 24° в темноте. Затем отбирали одинаковые проростки 5-6 мм длиной и помещали по 10 штук в чашки Петри на агар корнями к центру и накрывали корни отрезками фильтровальной бумагой. Испытуемые растворы наносили на точку роста проростков. В качестве контроля использовали дистиллированную воду и раствор гибберелловой кислоты (ГК₃) в концентрации 10 мг/л. Чашки закрывали и помещали на 2 суток в условия постоянного искусственного освещения при комнатной температуре. Об активности растворов судили по изменению длины гипокотилей. Результаты представлены в таблице 3.

Согласно данным таблицы, культура штамма A. zeae OPN-14 при разбавлении в 10 раз проявляет очень слабый гиббереллин-подобный эффект.

Таким образом, можно заключить, что A. zeae OPN-14 обладает комплексной стимулирующей фитогормон-подобной активностью по отношению к растениям. Следует отметить, полученные результаты не обязательно являются свидетельством того, что заявляемый штамм продуцирует все рассмотренные типы фитогормонов. Но они указывают на то, что растения могут отзываться на обработку A. zeae OPN-14 так же, как и на обработку этими фитогормонами, т.е. активацией и усилением ростовых процессов.

Для эффективной реализации A. zeae OPN-14 рост-стимулирующей активности по отношению к растениям, необходимым условием является успешная колонизация этими бактериями их экологической ниши на корнях растений. Этому могут препятствовать различные факторы, в частности, летальное воздействие токсичных агентов, в роли которых в сельскохозяйственной практике чаще всего выступают пестициды.

Нами была проведена оценка выживаемости штамма A. zeae OPN-14 в рабочих растворах некоторых фунгицидов и гербицидов. Для этого готовили рабочие растворы пестицидов согласно инструкциям производителей, в которые добавляли жидкую культуру штамма A. zeae OPN-14, полученную на картофельном отваре. В контрольном варианте ту же культуру штамма добавляли в стерильную водопроводную воду. Оценку жизнеспособности клеток проводили через 4 часа после внесения бактерий в рабочие растворы пестицидов. Результаты представлены в таблице 4.

Согласно приведенным данным, в рабочих растворах многих исследованных пестицидов штамм сохраняет жизнеспособность не хуже, чем в воде. Устойчивость A. zeae OPN-14 к химическим пестицидам не только делает возможным их совместное применение в баковых смесях, но и в случае использования фунгицидов обеспечивает преимущество азоспириллам за счет угнетения жизнедеятельности конкурентов. Однако при использовании этого микроорганизма следует тщательно подбирать химические средства защиты растений.

Помимо наличия и проявления полезных свойств, для микроорганизмов, являющихся потенциальными активными агентами биологических препаратов, актуальной остается проблема их низкой жизнеспособности в составе этих препаратов при длительном хранении и применении в неоптимальных условиях. Это является серьезным препятствием для масштабного промышленного применения неспорообразующих бактерий в составе биопрепаратов. Для представителей рода Azospirillum известна способность к длительному сохранению жизнеспособности в составе жидких культур (Кушнерук М.А. с соавт., 2014; Sadasivan L., Neyra С.А., 1987). Для жидкой культуры A. zeae OPN-14 также было показано, что титр живых бактериальных клеток сохраняется практически неизменным как минимум в течение года с момента получения жидкой культуры. Кроме того, рост-стимулирующая активность в процессе хранения полностью сохраняется, что было подтверждено экспериментально. Для этого семена редиса сорта Ранний Красный замачивали в течение двух часов в жидкой культуре A. zeae OPN-14, разбавленной в 10 раз для получения титра порядка 10⁸ КОЕ/мл. После этого семена раскладывали в чашки Петри диаметром 10 см на смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу и проращивали в темноте при температуре 23°С в течение трех суток, после чего измеряли длину главного корня проростков. Данные представлены в таблице 5.

Также было отмечено усиленное образование корневых волосков во всех опытных вариантах по сравнению с контролем. Таким образом, можно заключить, что A. zeae OPN-14 может быть основой промышленно выпускаемого биопрепарата не только благодаря своей биологической активности, но и с точки зрения технологичности и удобства применения.

Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается, следующими примерами.

Пример 1. Оценка стимулирующего воздействия A. zeae OPN-14 на рост гороха в вегетационном эксперименте.

Семена гороха сорта Алтайский изумруд без видимых дефектов разделяли на две пробы по 30 г. Одну из них обрабатывали полусухим способом жидкой культурой A. zeae OPN-14, разбавленной до титра порядка 10⁸ КОЕ/мл, а вторую - контрольную - стерильной водопроводной водой. Емкости с семенами прикрывали крышкой и оставляли в темном месте при комнатной температуре на сутки.

На следующий день производили посадку семян по 15 штук в пластиковые кюветы, заполненные почвой. Перед посадкой почву тщательно рыхлили и увлажняли до полной влагоемкости. Растения выращивали на светоплощадке при температуре 24-25°С и продолжительности светлого времени суток 16 часов. Полив осуществляли водопроводной водой по мере необходимости. Через 14 суток растения извлекали из кювет, освобождали от почвы и определяли длину и сырую массу корней и побегов. Кроме того, в листьях определяли суммарное содержание хлорофилла. Результаты представлены в таблицах 6 и 7.

Приведенные данные свидетельствуют, что рост-стимулирующее воздействие A. zeae OPN-14 начинает проявляться уже на ранних этапах роста и развития растений.

Пример 2. Оценка влияния A. zeae OPN-14 на продуктивность растений подсолнечника в мелкоделяночном эксперименте.

Эксперимент проводили на подсолнечнике сорта Флагман в Краснодарском крае в период с апреля по сентябрь 2016 года на экспериментальной базе ВНИИБЗР. Метеоусловия вегетационного периода оказались такими, что период от посева до фазы 6-8 листьев был оптимальным по температуре, влажности воздуха, а также по количеству осадков. Зато в период интенсивного роста растений, цветения и формирование урожая, начиная со второй декады июня, резкое повышение среднесуточных температур и снижение влажности воздуха, особенно в июле и августе, существенно повлияло на ростовые и формообразовательные процессы у растений подсолнечника.

В процессе вегетации растения дважды обрабатывали A. zeae OPN-14 посредством опрыскивания. Первое опрыскивание было проведено в фазу 3-5 листьев, второе - в фазу «звездочка». Варианты опыта были следующими: 1) контроль - растения обрабатывали водой; 2) жидкая культура A zeae OPN-14 с нормой расхода 2 л/га; 3) жидкая культура A. zeae OPN-14 с нормой расхода 1 л/га; 4) жидкая культура A zeae OPN-14 с нормой расхода 0,2 л/га. Во всех случаях расход рабочего раствора был 300 л/га.

Учет структуры урожая был проведен в фазу полного созревания. С каждого варианта отбирали по 40 растений; с каждой делянки срезали корзинки и обмолачивали их на комбайне. Массу семян с делянки определяли с точностью до 5,0 г. С каждой повторности отбирали по 250 г семян в одну смешанную пробу для последующего анализа. Результаты представлены в таблице 8.

Таким образом, заявляемый штамм обеспечивает существенное повышение урожайности подсолнечника.

Пример 3. Оценка влияния A. zeae OPN-14 на продуктивность растений яровой пшеницы в полевом эксперименте.

Исследования проводились на опытном поле лаборатории разработки систем защиты зерновых культур Технологического центра по земледелию Московского НИИСХ «Немчиновка» на посевах яровой пшеницы сорта Любава. Схема опыта:

1. Контроль. Фон N₆₄P₆₄K₆₄

2. Фон (NPK)₆₄ + жидкая культура A. zeae OPN-14 с титром 10⁹ КОЕ/мл. Предпосевная обработка за 24 часа до посева, расход микробной культуры - 1,0 л/т, расход рабочего раствора - 10 л/т. Опрыскивание вегетирующих растений - в фазе кущения - выхода в трубку, расход микробной культуры - 1,0 л/га, расход рабочего раствора - 300 л/га.

3. Фон (NPK)₆₄ + жидкая культура A. zeae OPN-14 с титром 10⁹ КОЕ/мл. Предпосевная обработка за 24 часа до посева, расход микробной культуры - 1,0 л/т, расход рабочего раствора - 10 л/т. Опрыскивание вегетирующих растений - в фазе кущения - выхода в трубку, расход микробной культуры - 2,0 л/га, расход рабочего раствора - 300 л/га.

4. Фон (NPK)₆₄ + жидкая культура A. zeae OPN-14 с титром 10⁹ КОЕ/мл. Предпосевная обработка за 24 часа до посева, расход микробной культуры - 1,0 л/т, расход рабочего раствора - 10 л/т. Опрыскивание вегетирующих растений - в фазе кущения - выхода в трубку, расход микробной культуры - 3,0 л/га, расход рабочего раствора - 300 л/га. Площадь опытных делянок 100 м², учетная площадь - 50 м²; повторность - четырехкратная.

Следует отметить, что семена, помимо культуры микроорганизмов, были также протравлены препаратом Винцит Форте в дозе 1,0 л/т, а опрыскивание вегетирующих растений проводили совместно с фунгицидом Альто Супер в дозе 0,5 л/га. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 9.

Следует отметить, что предпосевная обработка семян яровой пшеницы жидкой культурой A. zeae OPN-14 также способствовала повышению полевой всхожести от 7 до 10%, при этом всходы появились на 2 дня раньше, чем в контроле. В процессе вегетации у обработанных вариантов наблюдался более интенсивный рост стеблей. Опрыскивание вегетирующих растений поспособствовало увеличению количества продуктивных стеблей.

Также важно отметить, что при одинаковом количестве зерен в главном колосе в контрольном и опытных вариантах, их масса при обработке жидкой культурой A. zeae OPN-14 превышала контрольное значение. Обработка азоспириллами оказала заметное положительное влияние и на массу 1000 зерен.

В результате наблюдалось существенное повышение урожайности яровой пшеницы во всех вариантах обработки жидкой культурой A. zeae OPN-14. Кроме того, в зерне обработанных вариантов увеличилось содержание белка и клейковины - важнейших показателей для определения классности зерна.

Таким образом, технический результат заявляемого изобретения - стимуляция роста и повышение продуктивности сельскохозяйственных растений. Он достигается тем, что для обработки растений используется штамм бактерии A. zeae OPN-14, обладающий ярко выраженной рост-стимулирующей активностью за счет проявления фитогормон-подобного действия на растения и улучшения их минерального питания благодаря фиксации молекулярного азота, при этом устойчивый к некоторым химическим пестицидам и способный длительное время сохранять жизнеспособность и биологическую активность при хранении в виде жидкой культуры.

Использованная литература

1. Пожаский В.Г., Боканча И.Н. (2016). Биотехнологии - платформа будущего. Аграрный журнал «Рынок АПК». №8 (154). С.44-45.

2. Mehnaz, S. & Lazarovits, G. (2006). Inoculation effects of Pseudomonas putida, Gluconacetobacter azotocaptans and Azospirillum lipoferum on corn plant growth under green house conditions. Microb. Ecol. 51, 326-335.

3. Кушнерук M.A., Славкина E.A., Старичкова Н.И., Антонюк Л.П. (2014) Особенности выживания ризобактерии Azospirillum brasilense Sp245 в жидкой культуре при больших сроках хранения. Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия Химия. Биология. Экология. Вып.1, Т. 14. С.54-59.

4. Sadasivan L., Neyra С.А. (1987). Cyst production and brown pigment formation in aging cultures of Azospirillum brasilense ATCC 29145. J. Bacteriol. 169, 1670-1677.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии. Применение штамма бактерии Azospirillum zeae OPN-14, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12542, в качестве биологического агента с рост-стимулирующей активностью по отношению к растениям. Изобретение обеспечивает стимуляцию роста и повышение продуктивности растений. 9 табл., 3 пр.

Применение штамма бактерии Azospirillum zeae OPN-14, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12542, в качестве биологического агента с рост-стимулирующей активностью по отношению к растениям.