Способ определения скорости реакции агглютинации Советский патент 1986 года по МПК A61K39/00 G01N33/555 

1

И.«)б|Н u-iini огиосится к мелнцине, а ичччик) к .;1()гии, и может быть ис- III 1,11, iDHinio iipii опреде-тении i-pyiiiioHOH и lui.ioHoii припал,к жносги крови, а также для шчмедоваиия антшччюв поверхности мпкро- оргаии (Moii.

Це 11) и (Обретения повышение точио- eiM способа с |)ди()в|)еме11Н1 1м сокращением времени ,, 1И ia.

1.)и способе О111)елеления скорости реакции к.иточиой aiчмютииации, включающем добавление к суспенчии клеток агглютинина, инкубацию смеси с измерением оптической плотности суспенчии до и носле инкубации, онтическук) плотность измеряют иослеловате, и)НО нри двух значениях длины ио,ти1)1 света в интервале 450 1100 нм, а скорость )еакннн а1 1МК)гина11ИИ он)еделя- н и по 1|)ормуле

v зсо. Г- 1ц(1),/1).)/1к(

4 1 1- 19

г

(Di /Dn/lR(A2/.i

где 1)| и I)j оптическая плотность сусиеп- зии, измеряемая при значениях длины волны соответственно А и Л2 до инкубации; I); и 1) ;,опгическая плотность сусненЗИН, измеряемая при указан- HI.IX значениях длины вол1п 1 нос le инкубации; .BjH MH инкубации ,

,1. 1М систем пени мептированных клеток и iii iiKiKni cinn.ix днснерсионных сред нитер- Г..1, iiiiii iui,iH )г равиым 450 ti Jii ip. i. ,1 1,1я э|)н 1-роцитов 790 1100 нм. ),п1 v4i T пзменепия коуффи- lutvuia, рас14 яиия сшта и радиуса частиц при ai: ,110: инаиии ос шествляетси но вс личи

,.,),

- I

(2.)

/Ч

K iropavi завися г o s )азмера и пока;(аге, 1я пре, ,1еиия частиц, по пе зависит от их коп- неп грации, 11)И увеличепии ра;)мера частиц оптическая п,1()ТН()сгь к, 1еточных cyciien;uni становится ве,1Т1чиной, относите.чьио слабее завис яше oi д,1ины волны СЕК та, Поэтому 11 ;1 01К ссе arr,-iK)THHaiuiH к,:|еток 1араметр 11 меиыпается.

( iioc()6 осу1цес 1вляется с,тедук)1цим обра iONi ,

К рас1ВО()у агг,тк)ТИ11Ина в 0,15 Л раство- pi .l добавляют такое количество кониенгрировапн()11 (N порядка И) см ) к,1егочп()11 B;iBeui, что начальное ; Иачение оп () n,;ioTH()CTH получеиной суспеп- зии к, ПС превышает 0,7 во всем диапазоне длин во,1н. Культура клеток иредвари- те, 1ьно (пмывают физиологлшеским раствором, а эритроциты обрабатывают трипсином. Оигичеекую плотность и; меряк)т через каждые 5 10 мин в течение времени инку- багги. с(1с ; ав, 1ЯЮ1цег() 20 60 мин. Пе)ед и;(

мерением суспензии к,четок 1е)емен1ивак)т в лечение Л(} НО с встряхиваиием кюветЬ) е клеточно1 в:(весью либо с исиоль:и)ванием магнитной меп1а,;:ки. Измерения проводя г на спектрофотометрах и,т и ко,:|ори метрах; ФЭК , ФЭК ()0, (Ф 2f) и т, и. При ис- поль;1овации спектрофотометров (,Ф 4, (Ф 2В целесообразио неред фотоЬ1лемен- том помещать круглую диафрагму с отверстием диаметром 2 3 мм д:1И снижения :)(1фекта ма.1оуглово1 о рассеяния евета. Опыты проводят в стандартньгх кк;1ветах толщи- пой :5, 5, К), ,40 и 50 мм, которыми комплектуются указанные нриборы, /1ля контроля проводят измерения суснензий, 11о,11ученных при тех же условиях в 0,10 М Na(J бе i ai- г, 1Н)гинина,

По результатам измс рений оигической 1г:|о 1ности на iTanax пикубации опррсделяют

параметр

f/i

12 1ц(1). :1 1;Ьд(;1, Л/1 U/ 1 -- 100 i i / -Д )

2 |a(Dr:ПЛ: lt(Л- Л, J

V

прс дставляющии со()ои до, 1К) ai pei aTOB клеток, об()а;(;вавп1ихся к данному момецгу в)е- меии, от об1цего числа частиц в елинице обьема к,теточ}1ой взвес и до начала тинации. Интерна. в) 1, .ib;iye- мь1Й в фо)муле (1), и соответс вуюпше ему значение Р и - онределикп по )езу, 1ьга- там оцепки ; ависимос гн Р от в()емени инкубации 1 и выбирак)Т )авным максима,)11 величине временного иите|)вала, в котором параметр Р практически iiponopn uina, ieH нременп инкубации.

Пример . Исс,:|едуК)Г реакцию агг, 1К)Гинации микробных к,теток Azospirilliitri hrasi- leiise sp. 7 под действием лект ина пшеницы, 1 качестве iipeiiajiaT a .пектина ncno,ib.ui)T :( MVM Koii iipoBoii nniennm, ( аратов- ская -52, но, 1уч1Чцц.1Й экстра ирова11ием муки С1)еднсто помола 0,05 NHCJ, ко)|цептрация

белка 0,5 мг/мл. К pacTBcjpy ,1ект 11на в ра:1вед(Ч{ни 1;32 добав, 1ЯН)т концент |1ирован- ную ( 10 см ) взвесь к,н ток в количестве, достаточном л,1я но, 1уче11ия значений оптическ()11 плотности суспепзии не 6(),ice 0,7 во в(.-ем выбранном диапазопе д, 1ип

вoлtl, Измерения проводят на спектро|})ото- меграх (-Ф 4, или С.Ф 2 в кюветах t расстоянием межлу стенками 10 мм, помещая перед ())отоэлеме1ггом диа(рагму с круг ,тым отверстием диаметром , 5 мм. Для иск,1К)- чеиия : ф1}и кта 1 едим(Ч1тации клеточных aifie- гатов кюветч с микроорганизмами вст 1Яхи- неред и;шерениями в течение , с. ()итическ ю inoniocTb и;5меряк)т на д,1И- нах 1и.)лн 450 и 620 нм. По ре;1ул1/татам измерений и оценки .зависимости F от временн инкубации ()преде,тяют иите)1и1,т в|)е- мени t 20 мин и рассчитьшают скорость )еакции ai г.тютзшации , i9-±; 0,3 мин по фо|)му,Т1 ( I I.

В таблице приведена зависимость овти- ческих и структурных параметров суспензий Ax.uspirillum brasilense sp. 7 от времени инкубации с экстрактом пшеницы, содержащим лектин.

Способ дает информацию о ранних специфичных стадиях реакции агглютинации, когда эффект седиментации еще не наблюдается. Время считывания результатов реакции сокращается до 20-40 мин.

Повышение точности способа иллюстрируется следующим образом.

Изучена лектиновая активность сортов пшеницы к эритроцитам кролика. Скорость

Р У реакции агглютинации

I, М и hi

t 20 .мин) для сортов пщеницы СаратовО

,860,390,217О

1,820,400,22430

60

84

ская-52, Саратовская-29 и (арат()вская-41 равна соответственно 4,7; 1,8 и 0,3.

Одновременное определе}1ие скорости реакции агглютинации при однолучевой фотометрии но времени снижения оптической плотности на 50% от первоначаьпой ве.ш- чины (t 150 мин) дало значение 0,00,3 для всех трех сортов ншеницы, т.е. точность метода однолучевой фотометрии не нозво- ляет выявить различия в содержании лекти- на.

Таким образом, использование предлагаемого способа определения скорости реакции клеточной агглютинации иозволяет с высокой точностью количественно охарактеризовать наиболее ранние и снецифичные с;а- дии реакции агглютинации и сократить в 3-5 раз время анализа.

60

84