Штамм МYсорLаSма рNеUмоNIае 1, используемый для получения диагностикумов и диагностических иммунных сывороток Советский патент 1989 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 A61K39/40 C12N1/20 C12R1/35 

Морфологические признаки.

На агаризированной питательной среде Хсйфлика колонии развиваются на 5-й день. Они имеют плотный зернистый центр и прозрачную периферию. Клетки полиморфные в виде слабо ветвящихся нитей, шаров, зерен, что является типичным для культур мико- плазмы пневмонии,

Культуральные и биохимические свойства,

Растет в аэробных и анаэробных условиях, Метиленовый синий в концентрации 0,001-0,005% и ацетат тал- ЛИЯ в концентрации 0,05% рост не ин- гибирует. Разлагает в аэробных условиях глюкозу, мальтозу, ксилозу, ман нозу до кислоты, не разлагает аргинин и мочевины при росте на питатель ных средах. Вызьшает быстрый бета- гемолиз эритроцитов морской свинки, обладает способностью к гемадсорбции В отсутствии лошадиной сыворотки и дрожжевого экстракта не растет на среде Хейфлика.

Антигенная структура.

Штамм перекрестно реагирует с ан- тисьшороткой к штаммам FH, № 13В и 780 в реакции ингибиции метаболизма и реакции нейтрализации до титра. Меченая иммунная сыворотка в реакции эпифлюоресценции реагирует со штаммом 1 до тирра. Антисьшоротка к штамму FH реагирует с диагностикумами из штамма 1 до титра в реакции связывания комплемента и непрямой гемагглю- тинации. При обратной постановке реакций, т.е. когда диаГностикумы для рек и РИГА готовят из штамма FH и используют для их проверки антисьшо- ротку к штамму 1, они также идут до титра сьшоротки.

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Использование штамма № 1 для приготовления диагности- кума из микоплазмы пневмонии для РСК

Производственный штамм микоплазмы пневмонии, предварительно прошедший контроль на бактериальную стерильность, специфичность, отсутствие посторонних микоплазм, биологическую активность, засевают в литровые матрацы -(типа бутыли Новицкого) с 75 мл среды Хейфлика (200 мл бульона из триптического перевара говяжьего сердца, 20 мл дрожжевого экстракта, 50 мл лошадиной сьшоротки, глюкозы

10

25

15 - 20

.

- ,

365614

до 1%, фенолового красного до 0,002%, хлорида натрия до 0,5%, насьпценного спиртового раствора холестерола до 0,1%, пенициллина до 1000 ед/мл, пН 7,8). Инкубируют при , подщелачивая среду до рН 7,8 раствором гидроокиси натрия каждые 6-18 ч. Культуру выращивают 5 дней до образования равномерного слоя микоплазмы ,на стеклянном дне матраца под слоем питательной среды. Стерильньм резиновым шпаделам снимают слой микоплазм со дна матраца в жидкую фазу культуры и используют в качестве посевного материала для получения серии антигена. Посевной материал вносят в объеме 6 мл в 300 мл среды Хейфлика,которую затем распределяют по 75-80 мл в литровые матрацы. Посевы выращивают, как описано ранее. После образования достаточного слоя микоплазм на дне матраца питательную среду отсасьшают. Слой отмьшают от остатков питательной -среды 3-кратным споласкиванием буферным изотоническим раствором рН 7,6 и снимают со дна матраца резиновым шпаделем в свежую порцию такого же раствора. Полученный материал контролируют на бактериальную стерильность, содержание микоплазм (по мутности и биологической активности). Он имел мутность 170 ед.П СК, биоло30

35

40

45

50

гическую активность КОЕ,, мл

JO

и был бактериологически стерильным. Клетки микоплазмы пневмонии разрушают ультразвуком при 16 кГц в течение 20 мин. Полученный антиген в разведении 1:10 не обладает антикомплементарными и гемолитич€1скими свойствами, при определении антигенной активности методом шахматного титрования она составляет 220 ед.Антиген смешивают в соотношении 1:1 с 2%-ным раствором желатина на 20%-ной Ccixa- розе, фасуют в ампулы, лиофильно высушивают и запаивают под вакуумом. Готовый препарат имеет антигенную активность ПО ед., в разведении 1:5 не гемолитичен и антикомплементарен, не содержит жизнеспособных микоплазм в объеме 5 мл...

П р и м е р 2, Использование штамма № 1 для приготовления диагностику- ма из микоплазмы пневмонии для РИГА.

Дпя получения серии антигена про- изводственньй штамм засевают, вьфащи- вают в жидкой питательной среде Хейфлика, получают взвесь отмытых от

5

среды клеток, контролируют ее и обр батьшают ультразвуком, как в пример 1. Взвесь клеток обладает мутностью 190 ед. стандарта ГИСК, биологической активностью 1-0 . Антиген в разведении 1:10 не обладает гемолитическими и антикомплементарными свойствами, антигенная активность его составляет 250 ед. Антиген не содержит жизнеспособных ми- коплазм (определено посевом 5 мл на 50 мл среды Хейфлика). Сенсибилизируют акролеинизированные. эритроциты антигеном в присутствии бидиазотиро ванного бензидина и лиофильно высушивают в ампулах в растворе пептона после чего запаивают под вакуумом. Полученный препарат выявляет в ре- ферес-сьшоротке антитела в том же титре, что и предшествующие серии (:2560), специфичен при постановке контрольных опытов с сьшоротками крови иммунизированных и интактных животных, не содержит жизнеспособны микоплазм в объеме 2 мл. Эритроциты оседают за ч при постановке реагсции с неспецифической сьшоротко

П р и м е р 3. Приготовление анти- гена из штамма № 1 для получения диагностических иммунных сывороток.

Взвесь отмытых клеток микоплазмы пневмонии получают с использованием приемов, описанных в примере 1. Полученная взвесь содержит мл микоплазмы пневмонии и имеет мутность 160 ед. ГИСК, не содержит бактерий в объеме 2 мл, Для инактивации

40Штамм Mycoplasma pneumoniae 1

(коллекция микроорганизмов НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), используемый для получения диагностикумов и диагностических иммунных сывороток.

Таблица

Результаты перекрестного взаимодействия различных штаммов микоплазмы пневмонии с антисывороткамн к гомо- и г етерологичным штаммам в различных реакциях

вьиерживают взвесь отмытых клеток при -5-10 течение 14 дней, после чего вторично контролируют на бакте- риальну1а стерильность и наличие жизнеспособных микоплазм в объеме 2 мл.

Штаммы

Титры реакций при постановке их с антисьшоротками к штаммамг I I FH 1 780 1 ЗВ I I FH I 780 | 13В FH 1 FH I FH

Р. ингибидаи метабо- Р. нейтрализащ1и РИГА

Примечание. - типовой штамм (АТСС 15331);

- свежевьщеленный штамм

0

5

0

5

D

5

Серии, прошедшие соответствующий контроль, используют для получения Ш мунных сывороток. Полученные И1 5мун- ные сьшоротки вызывают появлет е зо-j ны задержки роста 4 -S 2 ьш в реакции ингибиции роста миколлазмы, в реакции ингибиции метаболизма 1:3200- 1:12800, в реакции эпифлюоресценцин 1;8-1:16 и в реакции связьшания комплемента 1:1280-1:5 20, Для получения длительно хранящегося препарата антител сыворотки в ампулах лиофильно высушивают и запаивают под вакуумом .

Диагностику1.1ы и диагностические сыворотки пол чениые с использованием штамма 1, стабильны при хранении при в течение 2 лет (срок наблюдения).

Результаты сравнительного испытания диагностикумов i-i диагностических сьшороток представлены в табл. 1-5. Штамм i отличается низкой вирулентностью для человека. При инфицировании людей через дыхательные пути в массивной дозе вызывает у высокочувствительных людей лишь слабо выраженные кратковременные симптомы заболевания.

Штамм обладает высокой репродукционной активностью: через 5 дней культивирования дает урожай в 300 раз , чем известный штамм, в условиях выращивания на поверхности матраца под слоем питательной среды.

Формула изобретения

РСК Р. эпифлюТаблица 2

Результаты испытания специфичности иммунных сьгоороток, полученных к штамму 1

Серологические реакции

Титры реакций при постановке их с антигенами, приготовленными из штаммов:

1

FH 78013В I М.

Таблица

Результаты сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленньтх из штаммов 1 и FH, при исследовании сьшороток крови лабораторных животных

FH

Незараженные кролики

Таблица 4

Результаты сравнительных испытаний диагностикумов, приготоаленных из штаммов 1 и FH, в серологических реакциях (РСК и РИГА)

гоминис Н-37

Таблица 5

Результаты сравнительных испытаний диагностикумов, приготовленных из штаммов 1 и FH, при обследовании парных сывороток людей, больных ОРЗ и острой пневмонией

FH 1

FH I

Дети Взрослые

3.3 3.5 3 3

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может найти применение при получении диагностических препаратов. Цель изобретения - новый антигенноспецифический, со сниженной вирулентностью, высокоурожайный штамм Mycoplasraa pneumoniae. Штамм получен методом клонироваШ1я исходного штамма FH-MO, депонирован в коллекции микроорганизмов НШ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи под номером К Штамм № I используют для получения антигенов, применяемых для-приготовления диагностикумов, для постановки РСК и PHrAs получения иммунньк диагностических сьшороток. 5 табл. колонии, .высевают их на жидкие среды. Культуры из отдельных колоний вторично фильтруют, сеют на плотные среды и вторично полученные из отдельных колоний культуры считают клоном. Среди них отбирают такие, которые отличаются слабой выраженностью цилиостатического действия и высокой репродуктивной активностью при росте на поверхности стекла под слоем жидкой питательной среды. Полученный штамм Mycoplasma pneumoniae депонирован в коллекции культур ВНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи /лаборатория микоплазм и L-форм ) под № 1 и .характеризуется следующими признаками. 00 со