ШТАММ БАКТЕРИЙ YERSINIA PSEUDOTUBER CULOSIS 7А, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРДОДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА Российский патент 1997 года по МПК C12N1/20 A61K39/02 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, используемый в качестве корпускулярного антигена для реакции агглютинации с целью серодиагностики псевдотуберкулеза в диагностической и научно-исследовательской работе.

Серодиагностика псевдотуберкулеза, наряду с бактериологическим методом, является основным звеном в лабораторной диагностике этой достаточно широко распространенной инфекции. В ряде случаев из-за невозможности диагностировать псевдотурберкулез по клиническим признакам и неэффективности бактериологического исследования (поздние сроки заболевания, внутриклеточная локализация возбудителя и др.), серодиагностика является практически единственным методом подтверждения диагноза. Используемые для серодиагностики реакции неравнозначны: в реакции агглютинации (РА) выявляются антитела к антигенам целых микробных клеток, а в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) к липополисахариду, выделенному из клеток возбудителя и фиксированному на поверхности эритроцитов (в соответствии с технологией получения коммерческого эритроцитарного диагностикума).

Применяемый в РА антиген должен представлять собой гомогенную взвесь микробных клеток эталонного, лучше местного, штамма с типичными свойствами и той антигенной структурой, которая выражена в период пребывания возбудителя в организме человека. Последнее особенно важно, так как для иерсиний характерна температурная зависимость ряда физиологических характеристик, в том числе многих антигенов (часть из них принимает участие в патогенезе заболевания).

В настоящее время в качестве антигена для РА используют референс-штаммы из международных коллекций. Например, для серодиагностики псевдотуберкулеза используют штамм Y. pseudotuberculosis серовара 01 (N 393) из Международного центра по иерсиниям (Париж). Данный штамм принят за прототип.

Известно использование эталонного штамма в качестве антигена для РА [1, 2] Перед приготовлением антигена его длительно пассируют в жидких питательных средах при низких температурах для накопления S-форм, проверяют культурально-морфологические свойства на питательном агаре, селекционируют колонии в S-форме, выращивают микроорганизмы на слабощелочном агаре (Хоттингера или МПА) при +17 24^oC в течение 24 36 ч. Для приготовления антигена используют взвесь, полученную после смыва агаровой культуры, непосредственно (живая культура) или после обработки микробной массы формалином (убитая культура).

Недостатком при использовании прототипного штамма является то, что для получения гомогенной взвеси клеток культуру выращивают при температуре ниже +30^oC, когда у микроба имеются жгутики и выражен H-антиген, а часть поверхностных антигенов, принимающих участие в патогенезе заболевания, не выражена (они выражены при температурном режиме хозяина +37^oC). Повышение температуры инкубирования до +37^oC приводит к спонтанному хлопьеобразованию в микробной взвеси из-за гидрофобности клеток, обусловленной, в частности, функционированием плазмиды вирулентности массовой 45 МД. Образование хлопьев в контроле антигена является препятствием для постановки РА с культурой, выращенной при +37^oC.

Цель изобретения получение штамма Y pseudotuberculosis, обладающего выраженной антигенной активностью без признаков спонтанной агглютинации и пригодного для использования в качестве антигена для РА.

Полученный штамм Y. pseudotuberculosis 7A депонирован в коллекции патогенных микроорганизмов РосНИПЧИ "Микроб" (справка о депонировании N 6/3-286 от 01.06.95).

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные палочковидные клетки размером 0,4 0,7 х 0,5 1,2 мкм слабоподвижны при температуре ниже +30 (перитрихи), при +37 неподвижны; спор и капсул не образуют. На жидких средах (Кларка, питательном бульоне) в аэробных условиях при +26 или +37 образуют равномерное помутнение и небольшой компактный осадок на дне. Аутоагглютинация не наблюдается. На среде Эндо при +37 колонии гладкие с относительно ровным краем, выпуклые, прозрачные с желтоватым оттенком, пастообразной консистенции, размером через 24 ч 0,6 1,0 мм, через 48 ч - до 1,2 1,8 мм, нередко с красным центром. При +26 колонии на той же среде меньшего диаметра (через 24 ч 0,4 0,8 мм, через 48 ч 1,0 1,5 мм) круглые, с ровным краем, голубоватые, иногда с красным центром. На агаре Хоттингера колонии имеют аналогичные характеристики.

Биохимическая активность. Ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, маннит, рамнозу, трегалозу, гидролизует эскулин; не ферментирует лактозу, сахарозу, сорбит, дульцит, инозит, целлобиозу; лизин и орнитин не декарбоксилирует, не обладает аргининдегидролазной активностью, цитрат не утилизирует, фенилаланин не дезаминирует; пробы Фогеса-Проскауэра при +37 отрицательны; пробы на индол, сероводород и с твином-80 отрицательны.

Антигенные свойства. Вступает в реакцию агглютинации с диагностической псевдотуберкулезной сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов эталонным штаммом Y. pseudotuberculosis серовара 01. Обладает общим энтеробактериальным антигеном.

Генетические особенности. Содержит плазмиду с мол.массой около 82 МД; плазмиду pYV не содержит. Устойчив к бензилпенициллину, оксациллину, эритромицину, фузидину, чувствителен к стрептомицину, канамицину, тетрациклину, карбенициллину, ампициллину, левомицетину, рифампицину.

Штамм 7A получен путем селекции на плотной питательной среде из популяции исходного штамма Y. pseudotuberculosis N 7, выделенного от больного псевдотуберкулезом в г. Москве в 1990 году. В отличие от родительского, штамм 7A стабильно поддерживает S-форму в диапазоне +26.+37^oC, способен образовывать гомогенные суспензии без признаков спонтанной агглютинации.

Использование штамма 7A осуществляют следующим образом.

Чистую культуру штамма выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хоттингера) при +37^oC в течение 18 24 ч. Смывают бактерии с агара 0,85% стерильным раствором хлорида натрия и дважды отмывают таким же раствором путем центрифугирования при 5000g в течение 15 мин с последующим ресуспензированием осадка. Доводят концентрацию клеток по оптическому стандарту мутности до 2•10 в 9 степени, добавляют формалин (в конечной концентрации 0,2% об.) и выдерживают при температуре +15.+25^oC в течение 20 24 ч. Реакцию агглютинации с сывороткой крови и готовым антигеном ставят и учитывают общепринятым способом, как правило, смешивая по 0,5 мл антигена с таким же объемом сыворотки в разведениях от 1:50 до 1:1600. Положительная реакция в титре 1:200 и выше, а также динамика титров антител в парных сыворотках позволяют диагностировать псевдотуберкулез.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами.

Пример 1. У больной Л. 16 лет, со средне-тяжелым течением осложненного псевдотуберкулеза на 4 месяце заболевания взята кровь для серодиагностики. После отделения от сгустка сыворотка прогрета при +56^o в течение 30 мин и разведена в 0,85% растворе хлорида натрия от 1:50 до 1:1600 в объеме 0,5 мл путем двукратных разведений.

Предварительно на агаре Хоттингера при +37^oC в течение 24 ч выращены культуры штаммов Y. pseudotuberculosis 7A, прототипного (393) и Escherichia coli, при 26^oC прототипного штамма. После приготовления смывов и отмывания бактерий в 0,85% растворе хлорида натрия суспензии стандартизированы по оптическому стандарту мутности до 2 млрд.кл/мл и обработаны формалином (0,2% ) в течение 20 ч.

Суспензии приготовленных антигенов внесены по 0,5 мл в пробирки с соответствующими разведениями сыворотки и в контроле антигена. После встряхивания пробирки выдержаны 2 ч при +37^oC и 18 ч при комнатной температуре. Результаты РА представлены ниже.

Следует отметить, что антитела к возбудителю псевдотуберкулеза в диагностических титрах выявлены по отношению к антигенам обоих штаммов, но в отношении штамма 7A в более высоком титре; антиген из прототипного штамма после преинкубации при +37^oC непригоден для использования из-за спонтанной агглютинации. Полученный результат позволяет серологически подтвердить псевдотуберкулез у больной Л.

Пример 2. У больного С. 19 лет, поступившего из очага псевдотуберкулеза с неясным диагнозом в конце 1 недели заболевания взята кровь для серологического исследования. Приготовлены двукратные разделения сыворотки крови от 1: 50 до 1:1600 в объеме 0,5 мл. На МПА в течение 24 ч при +37^oC выращена культура шт. 7A, при +26 культура прототипного штамма. После приготовления смывов, отмывания клеток, стандартизации суспензий до концентрации 2 млрд.кл/мл, а также обработки формалином (0,2% в течение 24 ч) готовые антигены по 0,5 мл внесены в пробирки с разведениями сыворотки и контроли антигена. Пробирки выдержаны 2 ч при +37^oC и 20 ч при комнатной температуре. При учете диагностический титр антител (1:200) выявлен только с диагностикумом из штамма 7A (с диагностикумом из прототипного штамма-титр 1:100). Следовательно, при использовании штамма 7A подтвержден диагноз псевдотуберкулеза у больного С.

Таким образом, предлагаемый для использования в качестве антигена с целью серодиагностики псевдотуберкулеза штамм N7A имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
для штамма 7A не характерна выраженная диссоциация при культивировании на питательных средах в температурном диапазоне +26.+37^oC; он не требует трудоемкого клонирования для получения S-формы и гомогенных суспензий, используемых в качестве антигена для РА;
в РА выявляются антитела в более высоких титрах, чем с антигенами из других штаммов; это повышает частоту серологического подтверждения псевдотуберкулеза;
штамм 7A выделен на территории Европейской части страны и имеет типичные для циркулирующих в этом регионе иерсиний биологические характеристики;
выраженная активность штамма 7A позволяет использовать приготовленный из него антиген в качестве высокого чувствительного и достаточно специфичного диагностикума для РА.

Использование: биотехнология, медицинская микробиология, диагностика псевдотуберкулеза, корпускулярный антиген для реакции агглютинации. Сущность изобретения: патентуется штамм бактерий Yersinia pseudotuberculosis A7, депонированный в коллекции РосНИПЧИ "Микроб" КМ N105. Штамм используют в качестве антигена для серодиагностики псевдотуберкулеза. Преимуществами штамма являются: стабильное поддержание S-формы, в том числе при температуре 37^oC, что позволяет приготовить на его основе высокочувствительный и достаточно специфичный корпускулярный диагностикум для реакции агглютинации. 1 табл.

Штамм бактерий Yersinia pseudotuber culosis 7А КМ N 105, используемый в качестве антигена для серодиагностики псевдотуберкулеза.