СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛ В L-ФОРМЕ Российский патент 2006 года по МПК A61K39/40 C12N1/20 G01N33/531 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к способу диагностики, используемому в качестве дополнительного теста, применяемого при лабораторной диагностике бруцеллеза, вызываемого глубоко измененными (L-) формами бруцелл.

Изобретение может быть использовано в научно-исследовательских и производственных лабораториях, занимающихся проблемами бруцеллеза животных.

Известно, что бруцеллы, как и многие другие возбудители инфекционных болезней могут существовать в природе в S-, R-, и L-формах, отличаются друг от друга по морфологическим и биологическим свойствам, степени патогенности и специфичности антигена и т.д.

Известно также, что одним из основных методов диагностики бруцеллеза животных является бактериологический, предусматривающий выделение (изоляцию) бруцелл из органов и тканей организма хозяина и в дальнейшем их идентификацию по морфологическим, тинкториальным, агглютинабельным и другим признакам. Однако существующий в настоящее время бактериологический метод диагностики позволяет выявить и идентифицировать бруцеллы, находящиеся в типичной (S-) и диссоциированной (R-) формах. И при этом не выявляет бруцелл, находящихся в глубоко измененной (L-) форме [1, 2].

При создании изобретения ставилась задача - разработать способ получения специфической диагностической сыворотки, пригодной для выявления и идентификации L-форм бруцелл.

Задача решается путем трансформации исходной типичной культуры (S-форма) вакцинного штамма В. abortus 19 при однократном воздействии стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл на плотной питательной среде с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и культивировании при 37-38°С в течение 4-5 суток. Полученную L-форму смывают физиологическим раствором, определяют концентрацию по стандарту мутности и инактивируют при температуре 85-90°С в течение 60 минут. Полученной взвесью иммунизируют кроликов путем трехкратного внутривенного введения в возрастающих дозах соответственно 60, 90, 120 млрд м.к. с интервалом 72 часа. Начиная с 5 дня после последнего введения инактивированной культуры у кроликов берут кровь и получают сыворотку. У полученной сыворотки определяют наличие специфических L-антител в пластинчатой реакции агглютинации с гомологичными культурами. Сыворотка, содержащая специфические L-антитела в титрах не менее чем 1:20-1:40 признается пригодной для диагностических целей.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что стабильную L-форму бруцелл получают под действием стрептомицина и именно в результате однократного воздействия оптимальной дозы, а не длительного воздействия возрастающих доз [3, 4, 5].

Стабильную L-культуру получают не на жидких питательных средах [6, 7], а на плотной питательной среде с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки, что значительно упрощает проведение дальнейших технологических процессов.

Инактивацию полученной L-культуры осуществляют при температуре 85-90°С в течение 60 минут.

Иммунизацию кроликов производят трехкратно внутривенно в возрастающих дозах.

Известен штамм В.abortus 19, который применяется для изготовления диагностикумов (антиген и сыворотка), используемых для идентификации типичных (S-) форм бруцелл [8]. Штамм состоит из мелких грамотрицательных коккобактерий размером 0,3-0,5 мкм, слабовирулентный, в целом стабильный, при посеве на плотные питательные среды дает рост колоний в S-форме, которые не воспринимают окраску по Уайт-Вилсону. Растет на средах с фуксином и не дает роста на среде с тианином в разведениях 1:25000, 1:50000, выделяет H₂S (сероводород). Дает отрицательные результаты в реакции термоагглютинации и в пробе с трипафлавином. Агглютинируется поливалентной S-сывороткой и не агглютинируется R-сывороткой.

Из штамма В. abortus 19 L-формы получали путем высева на плотную питательную среду, приготовленную на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки. В качестве индуцирующего фактора использовали стрептомицин в концентрации 2,5-5,0 ЕД/мл среды (табл.1). Посевы культивировали при температуре 37-38°С. L-культуру получали на 4-5 сутки.

Таблица 1.
Получение стабильной L-культуры бруцелл в опытах in vitroИзучаемый штаммДоза стрептомицина (ЕД/мл среды)0,10,250,51,02,55,010,020,040,0В.abortus 19ттттллоооПримечание: т - типичные; л - L-формы; о - отсутствие роста.

В результате неоднократно проведенных исследований установлено, что образование L-форм происходило при воздействии на исходную клетку бруцелл стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды. Меньшая концентрация антибиотика не вызывала образование L-форм бруцелл, а большая приводила к задержке роста и нередко к гибели культуры.

При высеве полученной L-формы на плотных питательных средах образуются колонии округлой формы, уплощенные, гладкие с ровными краями, беловато-серого цвета. На бульоне растут, образуя равномерное помутнение среды, с последующим просветлением и образованием обильного рыхлого осадка белого цвета на дне пробирки.

При микроскопии нативных мазков полученная L-культура представляла собой грамположительные гигантские клетки эллипсоидной формы (овоиды) размером 2,5-3,0×5,0-6,0 мкм.

L-форма В.abortus 19 в значительной степени утратила ригидную клеточную стенку. Она агглютинируется с L- и не агглютинируется с S-, R-бруцеллезными антисыворотками. Дает положительную реакцию термоагглютинации и пробу с трипафлавином. Не выделяет сероводород. Хорошо растет на средах с тионином и фуксином. Характеризуется слабовирулентными свойствами.

Пример 1

Получение бруцеллезной диагностической L-сыворотки осуществляли путем гипериммунизации кроликов полученной L-формой бруцелл. Для этого взвесь двухсуточной агаровой культуры инактивировали на водяной бане при температуре 85-90°С в течение 60 минут. Инактивированную L-культуру вводили внутривенно трехкратно с интервалом 72 часа в возрастающей дозе соответственно 60, 90, 120 млрд м.к. После иммунизации у кроликов проводили забор крови на 4-40 сутки.

Таблица 2
Специфичность и активность диагностической бруцеллезной L-сыворотки при постановке пластинчатой РА.Наименование штамма (культуры)Разведение L-сыворотки1:51:101:201:401:801:1601:3201:640Streptococcus becalis--------Staphylococcus aureus--------Yersinia enterocolitica--------Klebsiella oxytoca--------Esherihia colli В--------В.abortus 19 (S-форма)--------В.abortus544 (S-форма)--------В.suis 1330 (S-форма)--------В.rangifen 181 (S-форма)--------В.abortus 16/4 (R-форма)--------В.canis 2-99 (R-форма)--------В.abortus 19 (L-форма)+++++++++++++++++++++++++-В.abortus 544 (L-форма)+++++++++++++++++++++--В.rangifen 181 (L-форма)++++++++++++++++++---В.ovis 282 (L-форма)++++++++++++++++++---

Специфичность бруцеллезной диагностической L-сыворотки определяли в пластинчатой РА с гетероморфными (S-, R-) штаммами бруцелл, а также культурами йерсиний, эшерихий, клебсиелл, стрептококков, стафилококков (табл.2).

Наибольшую активность бруцеллезной диагностической L-сыворотки отмечали на 4, 7 сутки с диагностическим титром 1:180-1:320 при исследовании в пластинчатой РА.

Таким образом, бруцеллезная диагностическая L-сыворотка обладает строгой специфичностью и довольно высокой активностью и может использоваться в диагностических целях в рабочем разведении 1:10-1:20.

Изобретение поясняется следующими конкретными примерами использования диагностической бруцеллезной L-сыворотки.

Пример 2

В результате бактериологического исследования лимфатических узлов и внутренних органов от 20 опытных коров, находящихся с различным иммунологическим фоном и экспериментально зараженных вирулентным штаммом В.abortus 54, были выделены культуры бруцелл, находящиеся в различных (S-; R-; L-) формах.

Таблица 3
Результаты бактериологических исследований материала от коров на бруцеллез№ группы№ животногоКоличество объектовКоличество выделенных культур (всего)Из них бруцеллытипичные (S-форма)гл. изм-ные (L-форма)не бруцеллы11238017216801732374124226105518300326207610713410382671069211030710161512213111450141211104061317802614202002151021014162363031719701618201100111917600620216105всего20390138371091

При индикации 138 культур, изолированных от коров бруцеллы составили 34% (47 культур). При этом из 47 выделенных культур бруцелл. 37 (79%) имели признаки типичных бруцелл и 10 (21%) измененных форм бруцелл (табл.3).

Выделенные культуры бруцелл, находящиеся в измененном состоянии, характеризовались широким диапазоном агглютинабельных свойств(табл.4).

Таблица 4
Агглютинабельные свойства культур бруцелл, выделенных из биоматериала от опытных коров№ п/п№ субкультурыАгтлютинабельностьSSRRSLRLSRLL11261     + 21264     + 31266      +41286  +    51289     + 61290    +  71313   +   81318     + 91325     + 101328     + Всего0011161

Из десяти выделенных культур шесть имели в своем составе весь набор (SRL) антигенных комплексов и по одной несли в себе соответственно R-; SL-; RL-; L-детерминанты.

Пример 3

Бактериологическое исследование проводили в 10 стадах северных оленей с общей численностью 756 голов, находящихся в различной эпизоотической обстановке по бруцеллезу.

В качестве биоматериала использовали внутренние органы, лимфатические узлы и кусочки пантов.

Таблица 5
Агглютинабельные свойства культур бруцелл изолированных от северных оленей в пластинчатой РААгглютинабельностьКоличествоПроцентS5322,3R3816,0SR3615,2SL20,9RL166.7SRL2510,6L6728,3Всего237100

При идентификации 1135 выделенных культур, бруцеллы составили 20,8% (237 культур). Выделенные культуры характеризовались широкой вариабельностью агглютинабельных и других свойств (табл.5).

110 выделенных культур бруцелл (46,5%) находились в глубоко измененной форме и несли в своем антигенном составе наряду с различным сочетанием S- и R-антигенных комплексов еще и L-детерминанты.

При этом следует отметить то, что 28,3% выделенных культур бруцелл агглютинировались только бруцеллезной диагностической L-сывороткой.

Пример 4

Диагностическую эффективность бруцеллезной диагностической L-сыворотки определяли при исследовании 172 культур бруцелл, которые были выделены от баранов, зараженных гетероморфными штаммами В. ovis (табл.6).

В результате исследований было установлено, что 69 культур (40%) агглютинировались в реакции агглютинации на стекле с L-сывороткой. При этом 11 культур несли в своем составе только L-антигенные детерминанты, что составило 6,4% от общего числа исследованных культур бруцелл.

Таблица 6
Диагностическая эффективность L-сыворотки при идентификации культур, выделенных от баранов, зараженных гетероморфными штаммами В.ovisЗаражающий штаммИсследовано субкультурАгглютинировалось специфическими сывороткамивсегов том числеSRLтолько Lколич%92434343026818,621-801616115916,2006455959573213--75545429502123,7Итого1721729112769116,4

Таким образом, бруцеллезная диагностическая L-сыворотка, изготовленная из стабильной L-формы В.abortus 19, позволяет идентифицировать бруцеллы, находящиеся в глубоко измененном состоянии, и тем самым на 20-30% повысить надежность диагностики бруцеллеза у сельскохозяйственных животных.

Применение бруцеллезной диагностической L-сыворотки в общем, диагностическом комплексе дает возможность наиболее тщательно оценить эпизоотическую обстановку по бруцеллезу с учетом типичных (S), диссоциированных (SR- R-) и глубокоизмененных (LS-, LR-, LSR-, L-) форм бруцелл.

Владея этими знаниями, возможно, более успешно вести борьбу с этим опасным инфекционным заболеванием.

Список используемой литературы

1. Косилов И.А. Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Новосибирск, 1999. - С.77-83.

2. Наставление по диагностике бруцеллеза животных / Министерство сельского хозяйства РФ. - Москва. - Агропромиздат, 2000 - 92 с.

3. Островская Н.Н. и др. Биологические свойства пенициллиновых сферопластов бруцелл / ЖМЭИ. - 1974. - №9. - С.130.

4. Толмачева Т.А. Изучение L-трансформирующего свойства на клетки бруцелл тетрациклина, стрептомицина, риомицина и их комбинации с пенициллином в опытах in vitro / Антибиотики - 1976. - №9. - С.771.

5. Christophorov L., Peschkov U. Исследования въерху L-форми при бруцелл / Вет. мед. науки. - 1969. - 6 №2. - С.25-32.

6. Островская Н.Н. и др. К вопросу об образовании у бруцелл L-форм в условиях искусственной питательной среды / ЖМЭИ. - 1972. - №4. - С.108-112.

7. Хузин Д.А. и др. Получение и изучение L-форм бруцелл / Тез. Всесоюз. науч.-практ. конф. - Казань, 1983. - С.74.

8. Ветеринарные препараты. - Москва, 1981. - №6. - С.125-132.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Способ включает получение стабильной культуры из штамма B.abortus 19 в L-форме с последующей иммунизацией кроликов. Культуру получают на плотной питательной среде с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и однократного воздействия стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды. Из полученной культуры готовят взвесь, инактивируют ее при температуре 85-90°С в течение 60 минут и трехкратно внутривенно вводят кроликам в возрастающих дозах с интервалом 72 часа. Способ позволяет наиболее точно оценить эпизоотическую обстановку по бруцеллезу с учетом типичных, диссоциированных и глубокоизмененных форм бруцелл. 6 табл.

Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме, включающий получение стабильной культуры из штамма В.abortus 19 в L-форме, получение антигена, гипериммунизацию кроликов полученным антигеном с последующим забором крови и отделением сыворотки, отличающийся тем, что стабильную культуру из штамма В.abortus 19 в L-форме получают на плотной питательной среде, в которую добавляют 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицин в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл, антиген получают путем инактивации полученной культуры нагреванием при температуре 85-90°С в течение 60 мин, а гипериммунизацию кроликов осуществляют путем трехкратного внутривенного введения антигена в возрастающих дозах.