Штамм бактерий YeRSINIa еNтеRосоLIтIса серовара 03, используемый в качестве антигена для серодиагностики иерсиниоза Советский патент 1992 года по МПК C12N1/00 C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя иерсиниоза, используемый в качестве эталонного корпускулярного антигена для реакции агглютинации с целью серодиагностики иерсиниоза в диагностической и научно исследовательской работе.

Серодиагностика иерсиниоза. наряду с бактериологическим исследованием, является основным методом лабораторной диагностики этой инфекции. В ряде случаев из-за невозможности диагностировать иерсиниоз по клиническим признакам и неэффективности бактериологического метода (позднее сроки заболевания, внутриклеточная локализация возбудителя и др.), сероди- агностика является практически единственным методом подтверждения диагноза. Используемые для серодиагностики реакции - реакция агглютинации (РА) и реакция пассивной гемагглютинэции (РПГА) - неравнозначны, поскольку в первом случае в сыворотке крови больных выявляются антитела к антигенам целых клеток возбудителя, во втором - к выделеню

о

ному из них липополисахариду, фиксированному на поверхности эритроцитов (коммерческие эритроцитарные диагности- кумы).

Применяемый в РА для серодиагностики иерсиниоза антиген должен представлять собой гомогенную взвесь микробных клеток (живых или инактивированных) эталонного, лучше местного, штамма с типичными свойствами и той же антигенной структурой, которая выражена в период пребывания возбудителя в организме человека. Последнее особенно важно, так как для иерсиний характерно температурозави- симое выражение целого ряда физиологических характеристик, в том числе многих антигенов.

В качестве антигена для РА используют референтные штаммы из международных коллекций. Одним из таких штаммов является Y.emerocolitica № 134 (Международный центр по иерсиниям, Париж), который используют для серодиагностики заболеваний, вызываемых иерсиниями серовара 03. Штамм № 134 принят за прототип.

Известно использование эталонного штамма в качестве антигена для РА. Перед приготовлением антигена у него проверяют культурально-морфо-логические свойства на питательном агаре, селекционируют колонии в S-форме, выращивают микроорганизмы на слабощелочном агаре (Хоттингера или МПА) при 17-24°С в течение 24-36 ч.

Для приготовления антигена используют взвесь, полученную после смыва агаровой культуры, непосредственно (живая культура) или после обработки микробной взвеси формалином (убитая культура).

Недостатком при использовании штамма № 134 является то, что для получения гомогенной взвеси клеток, культуру выращивают при температуре ниже 30°С, когда у микроба имеются жгутики и выражен Н- антиген, а часть поверхностных антигенов, принимающих участие в патогенезе, не выражена. Их выражение происходит при температурном режиме макроорганизма (37°С). Повышение температуры инкубирования до 37°С приводит к спонтанному хлопьеобразованию в микробной взвеси из- за появления гидрофобных компонентов в наружной мембране клеток, что в свою очередь обусловлено функционированием в клетках штамма № 134 плазмиды вирулентности с молекулярной массой 40-48 МД. Образование хлопьев в контроле антигена является препятствием для РА с культурой, выращенной при 37°С.

Цель изобретения - получение штамма Y.enterocolltica серовара 03, обладающего

выраженной антигенной активностью без признаков спонтанной агглютинации, используемого в качестве антигена для РА. Полученный штамм Y.enterocolitica №

955L депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича (N; 189, справка № 010 07/115).

Морфологическая и физиологическая характеристики.

Грамотрицательные палочковидные клетки 0,5x1,1 мкм, подвижные при темпе5 ратуре ниже 30°С за счет перитрихиально расположенных жгутиков; при 37°С неподвижны, жгутиков не образуют. Спор и капсул не образуют. При культивировании на жидких средах (МПВ, бульон Хоттингера,

0 среда Кларка), независимо от температурного режима, образуют равномерное помутнение и небольшой компактный осадок, На среде Эндо через 24 ч при 37°С образуют колонии диаметром 0,2-0.3 мм, выпуклые,

5 круглые с ровным краем, бесцветные, гладкие, прозрачные, пастообразной консистенции; через 48 ч - диаметром 1,5-2,0 мм, розовые. Сходную морфологию имеют колонии на агаре Хоттингера. Свойством каль0 цийзависимости штамм не обладает. Биохимическая активность. Ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, сахарозу, маннит, мальтозу, глицерин, сорбит, трегалозу; не ферменти5 рует лактозу, рамнозу, салицин, эскулин, ксилозу, дульцит. Обладаетуреазой, катала- зой, орнитиндекарбоксилазой. Не образует индол, сероводород. Цитрат не утилизирует, фенилаланин не дезаминирует. Проба с ме0 тиловым красным положительна, на оксида- зу - отрицательная, Фогес-Проскауэра - положительна при 26°С и отрицательна при 37°С.

Антигенные свойства.

5 Вступает в реакцию агглютинации с адсорбированной диагностической сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов эталонным штаммом Y.enterocoiltica серовара 03 из международ0 ной коллекции, Обладает общим энтеробак- тириальным антигеном и групповыми антигенами, Спонтанную агглютинацию не дает.

5 Генетические особенности.

Штамм не содержит обычную для патогенных иерсиний плазмиду вирулентности с мол. м, 40-48 МД, гены которой контролируют синтез гидрофобных компонентов клеточной поверхности, а также свойства аутоагглютинации и кальцийзависимости

Вместе с тем, этот штамм (как и родительский № 955S) содержит низкомолекулярную R-плазмиду, контролирующую его устойчивость к стрептомицину. Он устойчив также к канамицину, бета-лактамным антибиотикам, эритромицину и линкомицину; чувствителен к тетрациклину, левомицетину, полимиксину.

Штамм получен путем селекции на каль- цийдефицитной среде из популяции исходного кальцийзависимого штамма 9555, выделенного в 1988 г. в Рязани от больного иерсиниозом, Штамм 955S типичен по свойствам, характерным для возбудителей иер- синиоза серовара 03; для него характерно наличие плазмиды 40-48 МД и связанных с ней некоторых признаков вирулентности, аутоагглютинации и кальцийзависимости.

В отличие от родительского, штамм 955L обладает сниженным потенциалом па- тогенности. Не проявляет вирулентности при конъюнктивальном заражении морских свинок и энтеральном заражении мышей. При заражении культуры ткани НЕр-2 (Зх хЮ кл/мл) отмечается умеренная адгезия и инвазия эпителиоцитов, внутриклеточное размножение отсутствует.

Использование штамма ГИСК Ms 189 осуществляют следующим образом.

Чистую культуру штамма выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хот- тингера) при 37°С в течение 18-24 ч. С помощью 0,85% стерильного раствора хлорида натрия смывают бактерии с агара и дважды отмывают их в том же растворе путем центрифугирования (5000дх15мин). Затем суспензию используют для постановки РА либо непосредственно (в виде живой культуры), либо после обработки формалином (в конечной концентрации 0,2 об.%) в течение 20-24 ч при комнатной температуре (в виде инактивированной культуры). Перед использованием концентрацию суспензии доводят по оптическому стандарту мутности до 10 кл/мл. Реакцию агглютинации с сывороткой крови и готовым антигеном ставят и учитывают общепринятым способом, как правило, смешивая по 0,5 мл антигена с таким же объемом сыворотки в разведениях от 1:25 до 1:1600. Положительная реакция в титре 1:200 и выше, а также динамика титров в парных сыворотках позволяют диагностировать иерсиниоз.

Пример. У больного К., 12 лет. со средне-тяжелым течением кишечной инфекции из кала выделены Y.enterocolitica серовара 03. В конце 3-й нед заболевания взята кровь для серодиагностики. После отделения от сгустка сыворотка разведена 0,85%- ным раствором хлорида натрия от 1:25 до

1:600 в объеме 0,5 мл путем двукратных разведений. На агаре Хоттингера при 37°С в течение 24 ч выращена культура шт. ГИСК № 189. После приготовления смыва и отмы- 5 вания бактерий в физиологическом растворе суспензия стандартизована по оптическому стандарту мутности до 109 кг/мл. Готовый антиген по 0,5 мл внесен во все разведения сыворотки больного, кроме

0 1:25, куда добавлено 0,5 мл физиологического раствора (контроль сыворотки). В отдельной пробирке смешано 0,5 мл суспензии антигена и 0,5 мл физраствора (контроль антигена).

5 Для постановки РА с известным антигеном на агаре Хоттингера при 24°С в течение 36 ч выращена культура шт. № 134. После приготовления смыва культура суспензирована в физрастворе до 109 кл/мл и по 0,5 мл

0 внесена в пробирки другого ряда тех же разведений сыворотки больного, поставлен соответствующий контроль антигена.

Аналогичным образом поставлена реакция агглютинации с антигенами из культур:

5 Y.enterocolitica Ms 134, Y.enterocolitica серовара 09 № 201L, а также E.coli и S.typhi, выращенных на агаре Хоттингера при 37°С в течение 24 ч, После встряхивания пробирки выдержаны 2 ч при 37°С и 18 ч при ком0 натной температуре. Результаты приведены в таблице.

Следует отметить, что титр антител в отношении предлбжеКного штамма несколько выше титра к референтному штам5 му Мг 134, хотя в обоих случаях антитела определяются в диагностических титрах.

За счет перекрестно-реагирующих антигенов выявлены также антитела: в диагностическом титре (1:200)- к бесплазмидному

0 штамму возбудителя иерсиниоза 09, в низких титрах - к другим энтеробактериям.

Выявление антител к шт. ГИСК № 189 в высоких титрах позволяет серологически подтвердить диагноз иерсиниоза 03 у боль5 но го К.

Пример 2. У больного Б., 34 лет, с легким течением бактериологически подтвержденного иерсиниоза (выделены иер- синии серовара 03) в начале 3-й нед

0 заболевания взята кровь для серологического исследования. Приготовлены двукратные разделения сыворотки крови от 1:25 до 1:1600 в объеме 0,5 мл. На МПА при 37°С в течение 18 ч выращена культура шт.

5 ГИСК Nfe 189. После приготовления смыва и отмывания в физ. растворе суспензия клеток стандартизована до 109 кл/мл. Затем к ней добавлен формалин до 0,2% (по объему); инактивированный антиген использован через сутки после выдерживания

суспензии при комнатной температуре В объеме 0,5 мл антиген внесен в пробирки с разведениями сыворотки; поставлены, как обычно, контроли сыворотки и антигена. Пробирки выдержаны 2 ч при 37°С и 20 ч при 20°С При учете выявлен диагностический титр антител - 1:200, Параллельная постановка РА с аналогичным антигеном из шт. Мг 134 позволила выявить антитела, но в титре ниже диагностического (1:100), Следовательно, при использовании антигена из шт. ГИСК № 189 подтвержден диагноз иер- синиоза,

Таким образом, предлагаемый для использования в качестве антигена с целью серодиагностики иерсиниоза штамм ГИСК Мг 189 имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом.

При использовании шт. ГИСК Ns 189 появляется возможность сохранения гладкой формы иерсиний при 37°С, отсутствие маскирующего действия Н-антигена и связанных с плазмидой вирулентности антигенов повышает специфичность получаемого ани

10

15

20

25

тигена для серодиагностики В РА выявляются антитела в более высоких титрах, чем с помощью прототипа, что повышает частоту серологического подтверждения иерсиниоза. особенно в сомнительных случаях Штамм выделен на территории СССР и имеет типичные биологические характеристики для циркулирующих в стране иерсиний се- ровара 03. Предложенный штамм не подвержен диссоциации при культивировании на питательных средах и не требует трудоемкого клонирования для восстановления S-формы. Выраженная активность шт ГИСК № 189 позволяет использовать приготовленный из него антиген в качестве активного препарата для РА, Работа с предложенным штаммом более безопасна для персонала.

Формула изобретения Штамм бактерий Yersinia enterocolitica ГИСК Мг 189 серовара 03, используемый в качестве антигена для серодиагностики иерсиниоза

Использование: медицинская микробиология, диагностика - использование в качестве эталонного корпускулярного антигена для реакции агглютинации (РА) с целью серодиагностики иерсиниоза Сущность изобретения: чистую культуру штаммя ГИСК № 189 выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хоттингера) при 37°С в течение 18-24ч. С помощьюО,85%-ного стерильного раствора хлорида натрия смывают бактерии с агара и дважды отмывают их в том же растворе путем центрифугирования

Результаты учета реакции агглютинации сыворотки крови больного К. с антигенами иерсиний сероваров 03, 09 и других энтеробактерий

Антиген, т-ра преинкуба- ции, °С

Титр реакции

1800

1:400

1:200 Менее 1:100

В контроле сыворотки хлопья отсутствуют, жидкость прозрачна; учету не подлежит

Контроль антигена

Равномерная муть

Хлопья на дне Равномерная муть