Способ получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза Советский патент 1987 года по МПК A61K39/04 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лабораториях и НИМ, изучаю- пщх механизмы формирования противотуберкулезного иммунитета.

Цель изобретения - повышение эффективности способа получения корпускулярной иммуногенной фракции ми- кобактерий туберкулеза.

Пример 1. Проводят посев микобактерий туберкулеза (после 3-5 пассажей) на жидкую (например, Сото- на) и плотную (например, Левенштейна Йенсена) питательные среды, причем в последнем случае в большом разведении (1:640 - 1:1280) и помещают в термостат ().

Ежедневно определяют количество колоний, и по log2 от среднего числа колоний строят крршую размножения (табл.1).

Основные стадии роста микобактерий туберкулеза бычьего вида приведены в табл. 1 .

В соответствир с полученными результатами бакмассу Б15К для дезинтеграции берут через 16 сут роста, а бакмассу М. bovis (данного штамма) - через 19 сут роста.

Для получения фракции оболочек микобактерий в конце лог-периода роста подвергают механической дезинтеграции в соответствии с параметрами, приведенными в табл.2. .

В качестве среды для суспендиро- вания используют физиологический раствор (р Н 7,0 - 7,2), в который вносят .бакмассу, после чего бактериальную суспензию посещают в камеру дезинтегратора, куда добавляют стеклянные бусы. Камеру дезинтегратора охлалодают в ледяной бане и проводят разрушение микобактерий туберкулеза в непрерывном режиме работы. По окончании процедуры разрушения надосадок переносят в сборный сосуд, стеклянные бусы .дважды промывают физиологическим раствором и объединяют с ранее полученным дезинтегратором. Неразрушенные микобактерий и крупные конгломераты удаляют центрифугированием при 2000g в течение 20 мин. Надосадок собирают, -осадок ресуспенди- руют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют при тех же режи мах. Эту процедуру повторяют дважды, полученные надосадки об7зединяют ицеит

рифугируют при 15000g 60 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в 0,5%-ном растворе тритона Х-100 в соотношении 1:50 при постоянном перемешивании в течение 10 ч (для БЦЖ) и 18 ч (для М,bovis) при 4 С.

Цитоплазматические структуры удаляют путем центрифугирования суспензии при ISOOOg в течение 20 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в 1М растворе хлористого натрия в соотношении 1:50 при постоянном перемешивании в течение 13ч

5 (для БЦЖ) и 18 ч (для М. bovis) при . Обработанную суспензию центрифугируют при 16000g 20 мин. Надосадок отбрасывают, осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и центQ рифугируют при l6000g 20 мин. Процедуру отмывания клеточных оболочек повторяют дважды.

Чистоту полученной фракции оболочек контролируют цитологически и бак5 териологически. Оболочки лиофилизи- руют известным способом.

Пример 2. Приготовление масляно-водной эмульсии оболочек ми- - кобактерий для иммунизации животных. А. 10 мг лиофилизированных оболочек микобактерий туберкулеза тщательно перемешивают с 0,25 мл стерильного вазелинового масла в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком и по каплям добавляют 9,75 мл 0,5%- ного Твипа-80 в .физиологическом растворе.

В результате в 10 мл масляно-водной эмульсии содержится 10 мг оболочек, соотношение масла и воды 1:39.

Б. 10 мг лиофилизированных оболочек микобактерий тщательно перемешивают с 0,20 мл стерильного вазелино-. вого масла в гомогенизаторе Поттера с тефлоновым пестиком и по каплям добавляют 9,8 мл 0,5%-ного раствора Твина-80 в физиологическом растворе. В 10 мл масляно-водной эмульсии содержится 10 мг оболочек, соотношение масла и воды 1:49.

0

5

0

5

0

55

Пример 3. Изучение протек- тивного эффекта оболочек БЦЖ и М. bovis на морских .свинках.

Приготовленную масляно-водную эмульсию оболочек БЦЖ и М. bovis вводят подкожно морским свинкам в область медиальной поверхности бедра однократно в разных дозах.

Протективный эффект противотуберкулезной иммунизации морских свинок

приведены в табл.3.

I

Одновременно животньпс тем же способом иммунизируют целыми живыми и убитыми БЩ. Через 2 мес всех животных подвергают контрольному заражению вирулентными микобактериями туберкулеза и регистрируют падеж в экспериментальных группах в течение последующих 3 мес. Протективный эффект оцениваю,т по средней продолжи- тельности жизни. Как следует из табл.3, оболочки БЦЖ в дозе 0,1 мг на животное и оболочки М.bo- vis в дозе 0,37 мг на животное индуцируют противотуберкулезную резистентность, не уступающую по средней продолжительности жизни иммунизации вакциной БЩ в дозе 1 мг на животное при однотипном способе введения, в чем проявляется им- муногенность полученной по предлагае способу фракции оболочек мико- бактерий туберкулеза. Сама по себе масляно-водная эмульсия, целые живые и убитые Б1Щ в масляно-водной эмульсии не защищают животных от заражения туберкулезом. Оболочки М. bovis

в дозе 0,03 мг на животное не обладают протективным эффектом .

Б1Щ1-1112-16С17

Mycobacterium

bovis 81-n12-19С20

Таблица2

Стеклянные бусы,

диаметр

Соотношение бакмасса: физиологической раствор :бусы

38859

Формула изобретения

Способ получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза, включающий выращивание ми- кобактерий туберкулеза на питательной среде, сбор бакмассы микобакте- рий, их механическую дезинтеграцию, осаждение неразрушенных микобактерий, концентрирование и очистку фракции клеточных оболочек с последующей лио- филизацией целевого продукта, о т- л и. чающийся -тем, что, с целью повышения эффектности способа,

- сбор.бакмассы микобактерий осуществляют с помощью бус в физиологическом растворе с рН 7,0 - 7,2 в течение 60...90 мин при соотношении бак- масса: бусы: физиологический раствор 1:2:1 ... 1,2:2,2:1,3, осаждение неразрушенных микобактерий осуществляют трехкратным центрифугированием при 2000g в течение 15...20 мин, концентрирование проводят путем центрифугиg рования надосадочной жидкости при 15000g в течение 60...90 мин, а по- следз/ющую очистку фракции клеточных оболочек проводят путем постоянного перемешивания осадка с 0,4...0,5%-ным раствором тритона Х-100, добавляемого в соотношении 1:40...1:50, и последующего отмывания корпускулярной фракции дистиллированной водой с двухкратнь1м центрифугированием при 15000...16000g в течение 20 мин.

Таблица 1

0

0

Скорость вращения бус 4000 об/мин Время дезинтеграции 60-90 мин

Таблица 3

Вакцина БЦЖ

Живые Б1РК в масляно-вод- ной эмульсии

Убитые нагреванием БЦЖ в масляно-водной эмульсии

Оболочки Б1Щ в масляноРедактор Н. Тупица

Составитель С. Светльппев

Техред Л.Олейник Корректор М. Максимипшнец

4159/4

Тираж 594Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 133035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

82,4 t 13,40

73,8 t 5,31

66,6 ± 3,49

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лабораториях и НИИ, изучающих механизмы формирования противотуберкулезного иммунитета. Целью изобретения является повьшение эффективности способа получения корпускулярной иммуногенной фракции микобак- терий туберкулеза. Сущность предлагаемого способа состоит в дезинтеграции микобактерий в конце логарифмической стадии роста (через 16 - 19 ч от момента начала культивирования). При этом концентрирование и очистка полученной иммуногенной фракции осуществляется в оптимальных режимах промывания и центрифугирования. Полученные при реализации предлагаемого способа иммуногенные фракции.микобактерий туберкулеза обладают выраженным протективным действием при их однократном подложном введении морским свинкам. 3 табл. а S (Л с