Способ получения фторпроизводных L-тирозина Советский патент 1987 года по МПК C12N11/04 C12P13/04 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментативному синтезу фторпроизводйых оптически активной D(-aминoкиcлoты-L-тирозина, которые могут быть использованы в медицине в качестве фармакологически активных веществ.

Цель изобретения - удешеёление процесса получения и повышение степени его безопасности.

Способ получения фтор-производньк L-тирозина включает следующие этапы.

Получение биокатализатора, т.е. иммобилизацию клеток-i Citrobacter in- termedius в криогель на основе поливинилового спирта (две). Данная опе- рация осуществляется по общей схеме так называемого криоконструиро- вания и заключается в смешении водного раствора ЛВС с суспензией клетрк и дальнейшем замораживании порций полученной смеси при (-10)- (-30) С в течение 12-24 ч, последующем оттаивании полученных частиц и .их промывке от неиммобилизовавшейся части клеток.

Биосинтез фторпроизводных L-тирозина с помощью биокатализатора в реакторе проточного типа при пропускании через него раствора субстратов, содержащего, г/л: О или лс-фтор-фе- нол 2; пируват калия (натрия) 10; ацетат аммония 15; пиридоксальфосфат 0,025; рН раствора субстратов 8,0- 8,3.

Выделение целевого продукта (2- илн З-фтор-Ь-тирозина) из раствора, получаемого после проточного реактора с иммобилизованными клетками. Операция выделения вклюхгает упаривание летучей части раствора при пониженном давлении, перерастворение остатка в воде и выделение аминокислоты на ионообменной колонке со смолой КУ-2 (в Н -фор ме) из смеси с другими веществами реакционной массы. После элюирования целевого продукта водным аммиаком, упаривания элюата, его

растворения в кислой среде фторпроиз- 50 зина данным способом

водное Lj -тирозюта осаждается добавле- Пример 1. 5г влажной биомаснием двууглекислого натрия и перекристаллизовывается из воды.

Выбор конкретных параметров пред- лат аемого способа получения фтор- производных L -тирозина обусловлен следующими моментами.

Концентрация раствора ПВС в суспензии с клетками, предназначенной

сы клеток Citrobacter intermedius, содержащей 23tl единиц тирозин-фенол- лиазы, суспендируют в 70 г водного gg раствора ПВС, содержащего 7,5 г полимера; после тщательного перемешивания полученную суспензию замораживают при -20 с порциями по 0,2-0,3 мл (время замораживания 18 ч). После от

5

для получения биокатализатора, составляет от 7 до 12%. При меньшей, чем 7%, концентрации полимера наблюдается некоторое вымывание включенных в криогель клеток, что нежелательно (снижается активность биокатализатора) . При концентрации ПВС вьш1е 12% наблюдается также снижение активности, но из-за ди(|)фузионных затруднений в концентрированном геле (для 14%-ного геля - около 69% от активности биокатализатора в случае 12%- ного криогеля).

Режимы замораживания (температура и время) зависят от концентрации ПВС в исходной смеси, объема замораживания порции вещества, имеющегося холодильного оборудования. Предлагаемые режимы выбраны на основании экспериментов, и предусматривают температуру криогенной обработки от -Ю до -30 С и ее время от 12 до 24 ч. Состав раствора и концентрации 5 веществ, необходимых для биосинтеза, фторпроизводных L-тирозина иммо- билизованньтми клетками Citrobacter intermedius, также найдены экспериментально, а использование орто- или мета-изомеров фтор-фенола дает возможность получать соответственно 3-фтор- или 2-фтор-тирозин.

Для выделения целевого продукта предлагается схема без использования органическ1-гх растворителей: раствор.

0

0

5

получаемый на выходе из проточного

реактора с иммобилизованными клетками, упаривают при пониженном давлении (например, с помощью роторного

испарителя), остаток перерастворяют

в воде и наносят на колонку с катионообменной смолой в H -форме (например, смола КУ-2); далее аминокислоту

элюируют водным аммиаком и упаривают

элюат досуха. После переосаждения

и перекристаллизации получают очищен- ньй целевой продукт.

.Ниже приводятся конкретные примеры получения фторпроизводных I-тиро-.

Пример 1. 5г влажной биомассы клеток Citrobacter intermedius, содержащей 23tl единиц тирозин-фенол- лиазы, суспендируют в 70 г водного gg раствора ПВС, содержащего 7,5 г полимера; после тщательного перемешивания полученную суспензию замораживают при -20 с порциями по 0,2-0,3 мл (время замораживания 18 ч). После отраствора ПВС, содержащего 6 г полимера; после тщательного перемешивания порции полученной суспензии объемом 0,3-0,4 мл замораживают при

таивания частицы 10%-ного по ПВС криогеля промывают стерильной водой и загружают в проточный реактор, куда затем подают раствор субстратов,

содержащий, г/л: о-фтор-фенол 2; пи- в течение 12 ч. После оттаива- руват калия 10; ацетат аммония 15 и пири- ния частицы 12%-ного по ПВС. криогеля доксальфосфат 0,025 (рН раствора 8,2), промывают стерильной водой и загру- Раствор субстратов подают непрерывно со жают в проточный реактор, куда затем- скоростью 45 мл/ч, собирая элюат в сбор- ю подают раствор субстратов такого же ник. За 10 дней непрерывной эксплуа- состава, что и в примере 1, имеющего

рН 8,3. Раствор субстратов подают со скоростью 40 мл/час, собирая элюат в сборник. За 1.0 дней непрерывной ра- . 15 боты накоплено 9,6 л элюата, который -. обрабатывают, как в примере 1. Получено 23 г 3-фтор-Ь-тирозина, константы вещества аналогичны примеру 1. Предлагаемый способ получения

тации накоплено 10,8 л элюата, который упаривают при 55-60 С и пониженном давлении (16 мм рт.ст.). Остаток перерастворяют в воде, наносят на колонку (1 л) с ионообменной смолой КУ-2 (Н -форма) и промывают колонку водой до нейтральной реакции. Аминокислоту элюируют 5%-ным водным аммиаком, элюат упаривают досуха. Остаток 20 фторпроизводных- -тирозина-дает воз-

растворяют в 1М НС1, а затем осаждают целевой продукт прибавлением бикарбоната натрия. Выпавший осадок отделяют, промывают холодной водой и перекристаллизовывают из дистиллирован- 25 вания целых клеток Citrobacter interной воды. Получают 25 г З-фтор-1-ти- medius взамен дорогому очищенному

ферменту - тирозинфенол-лиазе. Кроме того, данный способ увеличивает продолжительность функционирования биоНС1).30 катализатора, что позволяет длитель-

Пример2. 5 г влажной биомас- нов время непрерывно получать целе,сы клеток Citrobacter intermedius,

розина (Найдено, %: С 54,26; Н 5,07; N 7,09. Вычислено, %: С 54,27; Н 5,06; N 7,03; -8,5(с 4,1 М

содержащих 215 едршиц тирозин-фенол- лиазы, суспендируют в 95 г водного

вой продукт. Так, например, даже через 2 мес. иммобилизованные в крио- гель ПВС клетки продолжают работать раствора ПВС, содержащего 7 г поли- и катализировать синтез фторпроизвод- мера; после тщательного перемешива- ных L-тирозина.

ния порции полученной суспензии объ- Использование проточных реакто- емом 0,1-0,2 мл замораживают при в течение 24 ч. После оттаивания частицы 7%-ного по ПЕС криогеля промьщают стерильной водой и загружают в проточный реактор,-куда затем подают раствор субстра-тов, содержащий, г/л: ос-фтор-фенол 2; пируват

ров (.известной конструкции) и непре- рывных режимов работы биокатализато- 40 Р улучшает технологичность процесса получения фторпроизводных L-тирозина, Предлагаемая схема выделения це- левого продукта повьш1ает безопасность

процесса, так как позволяет отказать- натрия 10; ацетат аммония 15 и пири- g ся от использования органических доксальфосфат 0,025 (рН раствора 8,0). .растворителей - вся очистка проводится в водкой среде. .

Формула изобретения

Раствор субстратов подают непрерывно со скоростью 50 мл/ч, собирая элюат в сборнике. За 10 дней непрерывной эксплуатации накоплено 12,0 л элюата, g Способ получения фторпроизводных который обрабатывают, как в приме- L-тирозина, предусматривающий приго- ре 1. Получают 18 г 2-фтор-1-тирозина товление субстрата из фтор4«нолов, (Найдено, %: С 5.4,34; Н 5,16; N 6,90. пирувата и аммиака, смешение их с Вычислено %г С 54,7; Н 5,06; N биокатализатором, обладающим тиро- 7,03); . D -1.,40 (с 4, Ш НС1). зин-фенол-лиазной активностью, провеПримерЗ. 5г влажной био- дение реакции синтеза в оптимальных массы клеток Citrobacter intermedius, для нее условиях с последующим содержащих 250 единиц тирозинфенол- лением и очисткой целевого продукта.

лиазы, суспендируют в 45 г водного

1351974

раствора ПВС, содержащего 6 г полимера; после тщательного перемешивания порции полученной суспензии объ, в,

емом 0,3-0,4 мл замораживают при

в течение 12 ч. После оттаи ния частицы 12%-ного по ПВС. криог промывают стерильной водой и загр жают в проточный реактор, куда за подают раствор субстратов такого состава, что и в примере 1, имеющ

можность синтезировать целевой продукт в одну стадию и с абсолютной : нантиоселективностью; удешевляет процесс получения за счет использо Использование проточных реакто-

ров (.известной конструкции) и непре- рывных режимов работы биокатализато- 40 Р улучшает технологичность процесса получения фторпроизводных L-тирозина, Предлагаемая схема выделения це- левого продукта повьш1ает безопасность

Формула изобретения

Способ получения фторпроизводных L-тирозина, предусматривающий приго- товление субстрата из фтор4«нолов, пирувата и аммиака, смешение их с биокатализатором, обладающим тиро- зин-фенол-лиазной активностью, провеотличающийся тем, что.

б135197Аб

с целью удешевления процесса полу- medius, включенные в 7-12%-ный крио- чения и повьшения степени его без- гель поливинилового спирта, а про- опасности, в качестве биокатализатора цесс синтеза ведут непрерывно в реак- используют клетки Citrobacter inter- торе проточного типа.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ферментативному синтезу фторпроизводных Ь-тирозина, применяемых в медицине в качестве фармакологически активных веществ. Целью изобретения является удешевление процесса и повышение безопасности технологии очистки целевого продукта. Способ заключается в том, что готовят биокатализатор, представляющий собой проявляющие тирозин -феноллиазную активность клетки Citrobacter inter- medius , включенные в 7-12%-ный крио- гель поливинилового спирта, а получение фторпроизводных L-тирозина ведут непрерывно в реакторе проточного типа, из полученного на выходе из реактора раствора целевой продукт выделяют упариванием в вакууме с последующей очисткой известными методами ионообменной хроматографии и перекристаллизации. (Л со ел ;о -vj 4