Способ получения препарата кислой фосфатазы из дрожжей SасснаRомUсеS ceReVISIae Советский патент 1989 года по МПК C12N9/16 C12N11/04 

Изобретение относится к прикладной микробиологии и биотехнологии-, конкретно к способу получения ферментного препарата, содержащего кислую фосфатазу, продуцентом которой являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, и может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине, в научных исследо- ва1шях, где имеется потребность в таком ферменте как кислая фосфатаза.

Цель изобретения - повьпиеьше выхода кислой фосфатазы в расчете на количество дрожжевых клеток и ускорение процесса.

Способ заключается в том, что дня секреции кислой фосфатазы используют иммобилизованные цепые клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые функционируют в среде состава, г/л: глюкоза 20; хлористый аммоний 2,0; 0,2 М сук1данатный

Оуфср (pll 5,0) до 1 л, при 28-32 С с постоянной аэрацией п реакторе проточного типа, пргпшм ютетки включены г. 5-10%- ЬШ криогель на основе nojinniuuuionoro спирта, а из получаемого на выходе из реактора раствора препарат кисло фосфатазы дрож seii вьс;еляют осаждением холодным (-20) - (-30)С ацетоном.

Приме ение указаппо среды и ус- лови функционирования иммобилизованных дрохлсевых клеток позволяет биосинтез пpeи rylцecтвeн- но по пути секреции во внеклеточное пространство именно ие.т1он фос- фатпиьц а иепол1.-.зование дрожжевых icieToK в иммоби.иизованном виде дает возм1з:кпость, нод.цер кпвая концентрацию фермента в экстрацел.чюлярноГ ;avUvocTn ниже равновесной ностоян- Н1Л:1 отво;- ом элюата, интен- си.фикащ и секреции фермента, т.е. ПОВЫСИТ , продуктивность системы в отио-лскии 1.;исло1 ( осфатазы дрояокей. ИоБыисиш-л ДгЧнпого показггтсли сг.особ CTiiycT та.-.ке и увеличению сроков фупкь люц.чрог.амия системп в ITOJIOM. IjL.iOop в ;:;1честпр носителя иг-г-юбилиз

Baiiui-ix клсгпк дрС ;:жей кри зголи на ос noiiO- ;iojn.-:in Hnoj-., сиирт п (ЛВС.) оиус::свлсн , ч гс ;;апны| rijjni oCuia;i;iioT разии.той гетсрофазио но- pncToii cTpyK rypoii, что обе.спечпвает б.чагоп1)11ятные г.ловия д.чя ..ье, 1,е- HTcJiijUo :.ги ;е1оТ(Ч - li ьо ценны с 1чп-юфа 1Ни ми : ел}И- л ио.г од к клеткам шггатслъных веп;еств и от- во;; метаСииштов. Благодаря исноль- зуе:-.о;1 со итку плосуги приемов достигается 1-;аь; повьлисни.е выхода гмлевого проду;-;т:1, и ускорение процесса. Послсдш ф11)ект обусловлег как созданием i;eiipepLi:5H;TO процесса секреции, так и быстры-- отделением целевого 1а)одукта осалчдепиег-; оглаж- депным ацето:и5М.

р и м ер 1 . 50 ui сусиензии кчеток дро}:;же Saccharomyci.-s cerevi- siae, ir/r . -283 С , содержацс 2 ,4 О

i-jiei OK на 1 i-n, смеишвают с 50 мл

I

10/ -ного водного раетвора ИВС до но- лучения равномерно суспензии, которую расфасовывают иоршлями по 100 кл и зa opa aIвaют при -70 С в течение 5 мин. Затем переносят заь оро:кенн ле o6jja3 .4:i в холодиль лик с тсмггорлтуроГг 4°С, где выдерязшаюг 2ч ч (при этом происходит оттаива

3

0

0

ние) . Полученные частицы криогеля с в1спюченными в ник дрожжевыми клетками трижды промывают дистиллированной водой и помещают в стерильный прото чный реактор. Скорость подачи питательной среды состава, г/л: глю ;оза 20; хлористый аммоний 2,0; 2 М сукципатпый буфер (рН 5,0) до

Q 1 л, 20 MII/4 с постоянной ее аэрацией, температура 30°С. Элюат собирают в охлаждаемый до 4°С сборник в течение 64 ч. Ферментный препарат осаждают прибавлением холодно5 го (-20 с) ацетона при соотношении объемов осадителя и элюата 1,5:1. Осадок отделяют центрифугированием и высуцивают в вакууме (0,1 мм рт.ст) над активированным углем и

0 прокаленным хлористым кальцием.

1 ыход 90 мг белк , Удельная фосфа- тазная iKTjbinoiTi. 5 ед/мг белка, в.1ход в расче- пп -;г ходную биомассу (ир ,;дуктир11ост11/ .,Я ед. акт/10

5 клеток.

Пример . 100 мл суспензии 1;леток дрожжс S.nercvisiae шт. 38-1Г-П188, еодерл.ащей 2,8-10 клеток на I мл, смешиванл с 100 мп 15%-ного раствора 1ШС, готовят рав- номерш/ю сусиензига, которую расфа- совыва;пт порциями но 75 мкл и замо- раживаюч образцы при -70 С в тече- шге 7,5 мин. Далее, как в примере 1 , е той разнипей, что температу- функционирования иммобилизованных клеток составляет 28 С, а температура ацетона при осаждении белка -30 С. Получают 210 мг препарата е удельной фосфатазной активностью 5,2 ед/мг белка. Выход в расчете на исходную биомассу

ft

(продуктивность) 4,0 ед акт/10 клеток.

Пример 3. 25 мл суспензии дрожжевых клеток S. cerevisiae, шт. 64-1Г-П188, содержащей 2,1-Го клеток на 1 мл, смешивают с 25 мл 20%-ного раствора ПВС. Полученную равномерную суспензию расфасовывают по 50 мл и замораживают образцы при -70 С в течение 10 мин. Далее, как в примере 1, только температура функционирования иммобилизованных клеток 32°С, а температура ацетона при осаждении ферментного препарата . После отделения 31)Гпавшего осадка его растворяют в 10-кратном количестве дистиллирован5

ной воды, замораживают и высушивают лиофильно. Выход белка 45 fг. Удельная фосфатазная активность 5,2 ед/м белка. Продуктивность системы в отношении кислой фосфатазы 4,3 ед акт/10 клеток.

Данные таблицы иллюстрт-1руют выбо оптимальных параметров среды инкубации, позволяюпих достигнуть макси мального уровня секреции фосфатазы.

Увеличение концентрации глюкозы и хлористого аммония даже на 15-20% от цредлагаемых значений цриводит к катаболитной репрессии и резкому снижению (на 70-90%) выхода фосфатазы в среду, а уменьшение содержания субстратов в питательной среде на ту же величину создает дефицит углеродного и азотного питания клеток, что также отрицательно сказывается на продуктивности биотехнологической системы (секция фермента снижается почти в 2 раза) . Значе кия рН питательной среды также оптимальны (возможные колебания не должны превышать iО,2 ед. рН). Так например, при работе с иммобилизованными по примеру 1 клеткаьга, но при рН среды 4,7, секреция фосфатазы снижается на 33% по сравнению с оптимальным рН 5,0), а при функционировании иммобилизованных (по примеру 3) клеток при рН питательной среды 5,35 уровень секреции ниже почти на 50%.

Концентрация сукцинатного буфера (0,2 М) соответствует необходимому для дрожжевых клеток уровню изо- тоничности.

Данные таблицы и примеры 1-3 позволяют указать оптимальные концен - трации субстратов в питательной среде, г/л: глюкоза 20; 2; 0,2 М сукцинатный буфер (рН 5,0)

до 1 л.

Концентрация ПВС в его водном растворе, предназначенном для иммобилизации дрожжевых клеток, состав

ляет согласно предлагаемому способу 5-10%. При меньшей (5%) концентрации полимера криогель обладает низ кой механической прочностью, что приводит к значительному вымыванию клеток из геля. При концентрациях

r 0 5 5

0

0

5

72

ПВС в исходном растворе более 10% получается очень плотньп криогель, что затрудняет диффузию пешеетя, неблагоприятно сказывающун)ся нл продуктивности клеток в отношении целевого продукта (опыт показывает, что, например, в случае 13%-ного геля продуктивность клеток снижается на 41%) .

Таким образом, использование пред лагаемого способа гк злоляет повысить выход целевого продукта в 30-40 раз (от 0,11-0,14 ед. акт/10 клеток до 3,8-4,3 ед. акт/10 клеток), а также ускорить процесс благодаря повышению длительности непрерьшной секреции фосфатазы, а также замене ультрафильтрации на осаяадение ацетоном.

Формула изобретения

Способ получения препарата кислой фосфатазы из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий вьщеление / биомассы дрожжевых клеток, инкубацию на среде,содержащей глюкозу, источник азота и воду, в условиях, обеспечивающих секрецию кислой фосфатазы в культуральную жидкость и последующее концентрирование целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта в расчете на коли честно дрожжевых клеток и ускорения процесса, инкубации подвергают целые клетки дрожжей, предварительно иммобилизованные в 5-10%-ный криогель поливинилового спирта в реакторе проточного типа на среде, содержащей в качестве источ|шка азота хло- хлористый аммоний и дополнительно 0,2 М сукцинатный буфер с рН 5,0, при следующем соотношении компонентов, г/л:

Глюкоза20

Хлористый

аммоний2,0

0,2 М сукцинатный

буфер с

рН 3,0До 1 л

а целевой продукт концентрируют осаждением охлажденным до (-20) - (-30)С ацетоном.

СБ - 0,2 М сукцииатиый .

Изобретение относится к прикладной микробиологии, конкретно к способу получения ферментного препарата, содержащего кислую фосфатазу из дрожжей (КФД). Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности, медицине, в научных исследованиях. Цель изобретения - повышение выхода кислой фосфатазы в расчете на количество дрожжей клеток и ускорение процесса. Способ заключается в том, что для секреции кислой фосфатазы используются иммобилизованные в 5-10%-ный криогель поливинилового спирта клети дрожжей SACCHAROMYCES CEREBISIAL, которые функционируют в среде состава, г/л: глюкоза 20

хлористый аммоний 2,0

0,2 М сукцинатный буфер с PH 5,0 до 1 л, при 28-32°С с постоянной аэрацией в реакторе проточного типа, а из получаемого на выходе из реактора раствора препарат фосфатазы выделяют осаждением холодным (от -20 до -30°С) ацетоном. Способ позволяет увеличить выход фосфатазы в 30-40 раз и ускорить процесс получения целевого продукта. 1 табл.

Составитель В.Муроисц Редактор П.Гулько Техред М.ХодаиИч ,Корректор Т.Палий

Заказ 5393/27

Тираж 501

ВИИ1ШИ Государственного комитета по изобретениям н открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Подписное