Способ получения конъюгатов Советский патент 1987 года по МПК C07D519/04 C07K17/02 

Изобретение относится к новым им- муноглобулиновым (парным соединениям) конЪюгатам с фармацевтическими свойствами, в особенности с цитоста- тическим действием.

Предлагаемые парные соединения- конъюгаты можно представить следуюформулой:

/

ОН

7 j:|l-c,Hs

is .Sf

TJ

eji CHv - -CHj-

OCOCHiCH COtjg OH

где 3g - иммуноглобулин или иммуно- глобулиновый фрагмент; СООСН или СрШ,;

RV - R. СН, или СНО.

Цель изобретения - синтез новых конъюгатов иммуноглобулина или его фрагментов, обладающих более сильным .и селективным противоопухолевым действием по сравнению с винковыми основаниями.

Способ получения 4-сукциноилдеза- цетилвинбластина.

2 г 4-дезацетилвинбластина раство ряют в пиридине, к раствору которого добавляют 2 г анпадрида янтарной кислоты. Реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 5 ч (для этой реакции можно использовать температуры в интервале С). Летучие составляющие удаляют путем выпаривания в вакууме и остаток вводят в CHjCl. Слой промывают 5%-ным водныь раствором бикарбоната натрия, а затем водой. Органический слой высушивают и растворитель из него удаляют в вакууме, ,что даёт 4-сукциношщезацетилвинблас тин. - : .

Приведенную процедуру используют для получения 4-сукциноилвиндезина, 4-сукциноилдезацетилвинкристина, 4- -сукциноил-4-эпидексидезацетилвин- бластина.

Подобную процедуру используют для

90 мл упомянутого раствора добавляют при быстром перемешивании к 0,9 мл 10,7 мг/мп раствора кроличьего противомышинового ИгС в 0,34 М бо- 55 ратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5,5 ч, продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на колонке

получения 4-глютароилдезацетилвинблас- 1-27 см (21 мл) Био-Гель Р-6, уравно0

5

0

тина, применяя глутаровый ангидрид вместо ангидрида янтарной кислоты.

Любое случайное ацилирование 3-ОН - -группы можно реверсировать путем обработки на влажном силикагеле в соответствии с процедурой. По другому варианту соединения можно очистить от любых 3-ацилпроизводных или других побочных продуктов реакции Путем хроматографии обычно на силикагеле, используя в качестве раствора для элю- ирования смесь растворителя этилаце- тат/этанол.

Способ получения активированного 4-сукциноилдезацетилвинбластина.

1 г 4-сукциноилвиндезина смешивают с.380 мг N-метилморфолина в 20 мл метиленхлорида и добавляют 390 мг

0 изобутиллофррмата. Реакционную смесь перемешивают при температуре приблизительно О С в атмосфере азота в течение приблизительно 45 мин. Добавляют 795 мг N-гидроксисукцинимида и

5 реакционную смесь нагревают до температуры кипения раствора в атмосфере Nj с перемешиванием в течение приблизительно 45 мин. Реакционную смесь охлаждают. Охлажденную смесь промыQ вают деионизированной водой и сразу же высушивают над Naj SO. Осушающий агент отделяют фильтрацией и фильтрат выпаривают до сухого состояния в вакууме. : Пример 1. Виндезинсукцинои ловый конъюгат противомьш1инного ИгС кролика.

К раствор.у 4-сукциноилвандезина (25 мг) в сухом диметиформамиде

,. (ДМФА) (0,4 мл) добавляют при переме5

шивании 0,3 мл 11,4-мг/мл раствора Ы-гидроксисукцинимида в сухом ДМФА и далее 0,3 мл 41,7 мг/мл раствора 1-циклогексил-3-(2-морфолинозтил)- -карбодиимид-мето-р-толуолсульфона- та в сухом ДМФА. Смесь выдерживают при комнатной температуре в темноте в течение 48 ч и получают 0,25 мг/мл раствора 4-сукциноилвиндезин-К -гид- роксисукцинимидового сложного эфира.

90 мл упомянутого раствора добавляют при быстром перемешивании к 0,9 мл 10,7 мг/мп раствора кроличьего противомышинового ИгС в 0,34 М бо- 5 ратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5,5 ч, продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на колонке

3,136

вешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Собирают исключенный пик (4,9 мл). Проверяют на содержание белка и виндезина с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм, Конъюгат, приготовленный таким образом, содержит 7,9 моль виндезина на моль Иг. Пример 2. Виндезинсукциноил

моноклональный конъюгат антиостеоген- Q мыши в 0,34 М боратном буфере с рН ной карциномы кролика.8,6. Реакционную смесь перемешивают

300 мл 28 мг/мл раствора сложного при комнатной температуре в течение 4-сукциноилвиндезин-Ы-гидроксисукци- 4ч, затем разбавляют 3,5 мл 0,7 М нимидового эфира в сухом ДМФА, приго- хлорид натрия в 0,05 М фосфатном бутовленного аналогично способу, описанному в примере 1, добавляют при быстром перемешивании к -1,5 мл 19,8 мг/мп раствора моноклональной антиостеогенной саркомы мыши вО,34М

боратном буфере с рН 8,6. Смесь пере-2о пик собирают (28,24 мл) и анализируют на содержание виндезина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм-; К нъюгал-, полученный таким образом, содержит 5,8 моль виндезина на моль Иг.

30

мешивают при комнатной температуре в течение 4ч, затем очищают с помощью центрифугирования и продукт вьщеляют с помощью гель-фильтрации всплывшей части на колонке 1,5-26,5 см (46,8 мл) 25 Био-Гель Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (5,52мл). Определяют на наличие виндезина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конъюгат, приготовленный таким образом, содержит 8,7 моль виндезина на моль Иг.

Пример 3. Виндеэинсукцинои- ловый конъюгат моноклонального анти- меланомного антигена мьш1и.

200 мл 20 мг/мп раствора 4-сукци- ноилвиндезинового сложного N-гидро- ксисукцинимидового эфира в сухом ДMФA приготовленного аналогично способу, описанному в примере 1, добавляют при быстром перемешивании к 1,0 мл 21,2 мг/мл раствору моноклонального антималеномного антигена мыши в 0,34 М боратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной.температуре в течение 4 ч и продукт выделяют с помощью гель-фильФрацйи на колонке 1,5-26 см (45,9 мл) Био-Гель Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (12,31 мл) и анализируют на содержание виндезина и белка на 270 и 280 нм. Конъюгат, приготовленный таким образом, содержит 9,1 моль виндезина на моль Иг.

40

Пример 5. Дезацетилвинблас- тинсукционоиловый конъюгат кролика антимьш1иного Иг.

К раствору 4- сукциноилдезацетил- винбластина (18 мг) в сухом ДМФА (0,4 мл) добавляют при перемешивании 0,3 мл 7,97 мг/мп раствора N-гид- роксисукцинимида в ДМФА и далее 0,3мл 14,4 мг/мл раствора 1,3-дициклогекси-

35 карбодиимида в сухом ДМФА. Смесь держат при комнатной температуре в темноте в течение 19 ч, получив 18мг/мл раствора сложного 4-сукциноилдезаце- тилвинбластин-Ы-гидроксисукцинимидо- вого эфира

Добавляют 200 мл упомянутого раствора при быстром встряхивании к 1,8мл 8,02 мг/мл раствора кроличьего антимышиного Иг в 0,34 М боратном буфере

45 с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 ч, затем очищают центрифугированием, и продукт выделяют из всплывшей части с помощью гель-фильтрации на 1,5-2,5 см (44 мл) колонке Био- Гель Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (6,47 мл) и анализируют на содержание дезаце- тилвинбластина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конъ-, югат, полученный таким образом, содержит 9,0 моль дезацетилБИнбласти- на на моль Иг.

50

55

Пример 4. Виндезинсукцино- иловый конъюгат моноклонального ан- тикарциноэмЬрионного антигена мьш1и.

1,0 мл 22 мг/мл раствора 4-сукци- ноилвиндезинового сложного N-гидрок- сисукцинимидового эфира в сухом ДМФА, приготовленного по способу, аналогичному по примеру 1, добавляют с быстрым перемешиванием к 7,0 мл 21,4 мг/мл раствора моноклонального антикарциноимбриогенного антигена

15 фере с рН 7,4, и продукт вьщеляют с помощью гель-фильтрации на 3,2 24,4 см (196 мл) на колонке Био-Гель Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный

Пример 5. Дезацетилвинблас- тинсукционоиловый конъюгат кролика антимьш1иного Иг.

К раствору 4- сукциноилдезацетил- винбластина (18 мг) в сухом ДМФА (0,4 мл) добавляют при перемешивании 0,3 мл 7,97 мг/мп раствора N-гид- роксисукцинимида в ДМФА и далее 0,3мл 14,4 мг/мл раствора 1,3-дициклогекси-

карбодиимида в сухом ДМФА. Смесь держат при комнатной температуре в темноте в течение 19 ч, получив 18мг/мл раствора сложного 4-сукциноилдезаце- тилвинбластин-Ы-гидроксисукцинимидо- вого эфира

Добавляют 200 мл упомянутого раствора при быстром встряхивании к 1,8мл 8,02 мг/мл раствора кроличьего антимышиного Иг в 0,34 М боратном буфере

с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3,5 ч, затем очищают центрифугированием, и продукт выделяют из всплывшей части с помощью гель-фильтрации на 1,5-2,5 см (44 мл) колонке Био- Гель Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (6,47 мл) и анализируют на содержание дезаце- тилвинбластина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 нм. Конъ-, югат, полученный таким образом, содержит 9,0 моль дезацетилБИнбласти- на на моль Иг.

Пример 6. ДезацетилвинкрисТИНСУКЦИОНОИЛОВЫЙ КОНЪЮГаТ МОНОКЛОнальногср антимеланомного антигена мыши.

К раствору 4-сукциноилдезацетил- винкристина (10 мг) в сухом ДМФА (Оз1 мл) добавляют при перемешивании 0,2 мл 6,5 мг/мл раствора N-гидрокси- сукцинимида в сухом ДМФА и далее .0,2 М 24,0 мг/мл раствора 1-циклогек- сил-3(2-морфолиноэтил)-карбодиимид- -мето-р-толуолсульфоната в сухом ДМФА, Смесь выдерживают при комнатной- температуре в темноте в течение 65 ч, что дало 20 мг/мл раствора сложного 4-сукциноилдезацетилвинкристин-Ы-гид- роксисукцинимидового эфира,

200 мл упомянутого раствора добавляют при быстром перемешив ании к 1,О мл 22,7 мг/мл раствора монокло- нального антимеланомного антигена мыши в 0,34 М боратном буфере с рН 8,6. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч и продукт вьщеляют с помощью гель-фильтрации на 3,2-24,5 см (197 мл) колонке Био-Гель Р-6, уравновеше нной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (14,16 мл) и анализируют на содержание белка и дезацетилвинкристина с помощьюспектроскопии на 270 и 280 нм. Конъюгат, полученный таким образом, содержит 14,3 моль дезацетилвинкристина на моль Иг.

Пример 7. Дезацетилвинблас- тинсукциноиловый коньюгат антиадено- карциномы легких мыши.

350 мл 14,7 мг/мл раствора 4-сук- циноилдезацетилвинбластинового сложного N-гидроксисукцинимидового эфира в ДМФА добавляют при быстром перемешивании к 2,0 мл 20,0 мг/мл раствора моноклонального антигена антикарци- номы легких малых клеток легких мыши 0,34 М боратном буфере с рН 8,6.После перемешивания при комнатной температуре в течение 4 ч реакционную смесь доводят до рН 7,4, используя НС1, и очищают, центрифугированием. Продукт выделяют с помощью гель-фильтрации на 2,0-22,0 см (67,0 мл) колонке Био- Гель Р-6, уравновешенной раствором соли с фосфатом в качестве буфера. Исключенный пик собирают (9,7 мл) и подвергают анализу на содержание де- зацетилвинбластина и белка с помощью спектроскопии на 270 и 280 им. Конъ югат, полученный таким образом, содержит 7,5 моль дезацетилвинбластина на моль ИГ,

Данные концентрации и УФ-поглоще- ния по примерам 1-7 приведены в табл. 1.

Таблица 1

5

5

0

Пример 8. Способ получения

клеток, растущих в культуре. Их помещают в микротитровые трубки до уровня 10 клеток на трубку. Путём концентрирования клеток центрифугированием добавляют 0,2 мл аликвот раз- личных концентраций, конъюгатов. Клетки пересуспе.ндируют, инкубируют при 37 С в течение 30 мин, затем центрифугируют и удаляют всплывшую часть, Клетки затем суспендируют на тканевой культуре и помещают на микротитровые подносы для культур при уровне в 10 клеток на емкость. Через шесть дней в культуре определяют количество присутствующих клеток в каждой емкости и сранивают с клеточной формой приготовления, обработанной раствором соли с фосфатом в качестве буфера.

55 В одном эксперименте клетки мела- - номы человека обрабатывают либо вин- дезинсукциноиловым конъюгатом моноклонального антимеланомного антигена мыши (пример 3) или дезацетилвин