1
Изобретение относится к медицинской промышленности.
Сиособ получения противовирусного комплекса из культуры грибка штамма Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 является новым и состоит в том, что культуру грибка штамма Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 вырашивают на среде, содержашей источники углерода и азота, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости не смешиваюшимися с водой органическими растворителями, например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты.
Штамм грибка Sirodesmium diversum (Кук), получаемый из Государственного микологического института, находящегося в Ферри Лейн, Кью, Англия, по каталогу значится как С.М. 1.102519.
Культура хорошо произрастает на обычной микологической агаровой среде, и через 6 дней в колонии образуется центральный участок спорообразуюшего мицелия, окруженный зоной гиф, которая может быть как воздушной, так и погруженной или первично погруженной. Эта зона неокрашена. Спорообразуюшая область обычно темно-коричневого цвета с несушими споры клетками, возникающими
при росте на агаре или на воздухе. Рост может быть довольно энергичным, например, на солодовом агаре или неравномерным, например, на агаре Чапек-Доке.
Споры, образующиеся из ветвей конидиофор, видны в длинных, редко разветвленных цепях. Они представляют собой амероспоры и дидимоспоры (фрагмоспоры встречаются редко), развивающиеся от вершины к основанию.
Зрелые споры довольно толстые, но местами тонкие. Амероспоры шарообразные диаметром 10 (9-11) мм, дидимоспоры почти цилиндрические с сужением около перегородки 18 (15- 22)Х10 (9-15) мм.
Источником усвояемого углерода являются, например, многоатомные спирты - сахароза, глюкоза, лактоза, глицерин или маннит; источник полимеризуемого углевода, например крахмал; природные или синтетические масла
или жиры. Источник углерода содержится обычно в среде в количестве от 0,1 до 30% по весу.
Источниками усвояемого азота являются вещества органического или неорганического
происхождения. Они могут быть в форме нитрата щелочного или щелочноземельного металла или аммонийной соли неорганической или органической кислоты, например, нитрата
натрия, калия, кальция или аммония, тартрата аммоиия, сульфата аммония или фосфата аммония. Они могут быть также в форме аминокислоты, например глицина, в форме муки, например муки из семян хлопчатника, или жидкости моченой кукурузы, нептона, мочевины, дрожжевого экстракта или мясного экстракта. Можно использовать смеси двух или более указанных выше веществ. Обычно источник азота содержится в среде в количестве 0,001-1,0%.
Среда содержит меньшие количества таких элементов, как фосфор (например, в виде первичного кислого фосфата калия или вторичного кислого фосфата аммония), магний (например, в виде сульфата или карбоната магния), сера (например, в виде сульфата) и калий (например, в виде хлорида или карбоната калия), и ничтожные количества, следы железа, марганца, цинка, молибдена или меди.
В качестве водной питательной среды исиользуют среду под названием Чапек-Доке.
Выращивание ведут при температуре 15- 35°С, предпочтительно при 25°С.
В качестве не смещивающегося с водой органического растворителя используют, например, хлороформ, этилацетат, толуол или диэтиловый эфир, из которых предпочтительным является хлороформ.
Антивирусный комплекс состоит из восьми соединений, обладающих способностью задерживать рост вирусов. Это - Снродесмины А, В, С, D, Е, F, G и Н.
Сиродесмин А имеет структурную формулу, где RI - ацетил, R2 - водород и Н 2:
К,0.
NCH,
СН
Сиродесмин В имеет также структурную формулу I, но RI - ацетил, Ra - водород, а Н 4; у Сиродесмина С Ri - ацетил, Ra - водород, а Н 3.
При обработке комплекса, задерживающего рост вирусов, двуокисью серы образуется другое соединение, обладающее тем же свойством - Сиродесмин I.
Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, G, Н и I имеют следующие характеристики.
Сиродесмин А
Найдено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,8; S 12,8.
С2оН2бН2О852.
Вычислено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,8; S 13,2.
Масс-спектр. Отсутствует исходный ион, но
имеется сильный пик при (М-82)+. Найдено
м/е 422, 1731; С2оН2бН2О8; требует м/е 422,
1689. При обработке триметилсилилимидазолом (бензол, 60°С, 3 час) образуется бис-триметилсилилпроизводное, в масс-спектре которого отсутствует исходный ион, но виден слабый пик. Соответствующие (М.-СНз)+ при 5 м/е 615, 1689; C5H39N2O8S2Si2; требует 615, 1686.
Ацетилирование. При обработке уксусным ангидридом в пиридине в течение недели при температуре 22°С получается бис-ацетат с температурой плавления 186-189°С. Найдено, %: С 50,5; Н 5,3; N 4,9.
C24H3oN2OioS2.
Вычислено, %: С 50,7; Н 5,2; N 4,9.
Наибольщий пик масс-спектра (М-82) + при м/е 506, 1871. C24H3oN2Oio требует м/е 506, 1901.
При обработке Сиродесмина А уксусным ангидридом в течение 1 час при температуре 22°С получается моноацетат.
Найдено, %: С 49,9; Н 5,3; N 5,3; S 11,7.
C22H27N209S2.
Вычислено, %: С 50,0; Н 5,2; N 5,2; S 12,1.
На масс-спектре виден небольшой пик для (М-82)+ при м/е 496 и сильный пик для (М-82)+ при м/е 464.
При гидролизе Сиродесмина А 0,1 и. раствором ПС1 в метаноле получается дезацетилсиродесмин А с температурой плавления 198-201°С.
Найдено, %: С 48,4; Н 5,6; N 6,0; 8 14,3.
Cl8H24N2O782.
Вычислено, %: С 48,8; Н 5,6; N 6,3; 8 14,4.
В масс-спектре отсутствует ион, но виден сильный пик для (М-82)+ при м/е 380.
При обработке Сиродесмина А трифенилфосфином в хлороформе получается моносульфид.
Найдено, %: С 52,7; Н 5,7; N 5,8; 8 7,1.
С2оН2бН2О8.
Вычислено, %: С 52,9; Н 5,8; N 6,2; 8 7,0. Молекулярный ион виден при м/е 454.
Сиродесмин В Найдено, %; С 43,4; Н 4,9; N 4,9; 8 22,8.
С2оН2бН2О884Вычислено, %: С 43,6; Н 4,8; N 5,1; S 23,3.
Масс-спектр: исходного иона не видно, но виден сильный пик для (М-8з)+ при м/е 422. Спектр практически идентичен спектру Сиродесмина А.
При обработке бис-триметилсилилтрифторацетамидом (бензол, 50°С, 3 час) образуется бис-триметилсилилпроизводное. На масс-спектре исходный ион отсутствует, но виден слабый пик, соответствующий (М-СНз)+ при м/е 647, 1445; С25Нз9Н2088з812; требует м/е 647, 1407.
Сиродесмин С
Найдено, %: С 46,3; Н 5,1; N 5,1; 8 18,0.
C2oH26N20883.
Вычислено, %: С 46,3; Н 5,0; N 5,4; 8 18,5. Масс-спектр. Сильный пик, соответствующий (М-8з)+при м/е422.
Сиродесмин D
Молекулярная формула С2оН2бЫ2О88х, где х 4.
Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М-Sx)+ при м/е 422.
Сиродесмин Е
Молекулярная формула C2oH26N2O8Sx, где X равен, вероятно, 3. Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М-5х)+при м/е 422.
Сиродесмин F
Молекулярная формула C2oH26N2O8Sx, где X равен, вероятно, 3. Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М-5х)+при м/е 422.
Сиродесмин G Найдено, %: С 49,7; Н 5,4; N 5,7; S 12,6.
C2oH26N2O8S2.
Вычислено, %: С 49,4; Н 5,4; N 5,8; S 13,2.
Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М-82)+ при м/е 422.
Гидролиз. При обработке Сиродесмина С 0,1 Н. раствором НС1 в метаноле образуется дезацетилсиродесмин С; температура плавления 195-196,5°С.
Найдено, %: С 48,4; Н 5,5; N 6,5; S 14,6.
Ci8H24N207S2.
Вычислено, %: С 48,8; Н 5,5; N 6,3; S 14,4.
Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М-82)+ при м/е 380.
Ацетилирование. При обработке Сиродесмина С уксусным ангидридом в пиридине в течение 9 дней при комнатной температуре образуется бисацетат Сиродесмина С с температурой плавления 159-159,5°С.
Сиродесмин Н
Молекулярная формула С2оН2бН2О85х. Массспектр. Исходный ион отсутствует, по виден сильный пик для (М-Sx)+ при м/е 422. Сиродесмин I
Найдено, %: С 49,8; Н 5,5; N 5,5.
С2оН2бМ2О852.
Вычислено, %: С 49,4; Н 5,4; N 5,8.
Масс-спектр. Исходный ион отсутствует, но виден сильный пик для (М-S)+ при м/е 422 и слабый пик для (М-S)+ при м/е 454.
Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, Н и I и их производные разделяются методом хроматографии в тонком слое на силикагеле.
Сиродесмины, кроме I, выделяют из комплекса, задерживающего рост вирусов, например, при сочетании колонной хроматографии и препаративной хроматографии в тонком слое.
Комплекс, получаемый при экстракции грибкового бульона, выделяемые из него Сиродесмины А, В, С, D, Е, F, G, I, дезацетилпроизводные Сиродесминов А и G, моноацетат и моносульфид Сиродесмина А обладают способностью задерживать рост вирусов в присутствии клеток хозяина, в частности они обладают активностью в отношении реновирусов в присутствии эмбриональных легочных клеток человека, а также в отношении вирусов Кокссаки А и В и Эко-вирусов.
Активность в отношении реновирусов измеряют следующим образом. Легочные эмбриональные клетки человека выращивают обычным способом на минимальной специфической среде Игла с добавлением 1% телячьей сыворотки в стеклянных трубках при температуре 33°С. Восемь групп (по три в каждой) таких трубок обрабатывают испытуемыми растворами соединений в той же среде, содержащей 200, 50, 12,5, 3.1, 0,8, 0,2, 0,05 и 0,00 мг испытуемого соедитшпия в 1 мл раствора. Инкубацию производят при 33°С, и через 24 час в
каждую трубку помещают дозу риновируса, например, типа 2, соответствующую 100-кратной дозе культуры, вызывающей 50% инфекции. После дополнительной инкубации в течение
2 дней при 33°С каждую трубку исследуют визуально лля определения наличия цитопатического эффекта, вызываемого токсичностью соединения, которая характеризуется цитопатическим эффектом на весь слой клеток, а также для определения наличия цитопатического эффекта, обусловленного ростом вируса и который является характерным, фокальным цитопатическим эффектом, легко отличимым от токсичности соединений. «Активной дозой
испытуемого соединения называется концентрация соединения, которая защищает 50% клеток от цитопатического эфЛекта, вызываемого ростом вируса. «Токсичной дозой называют кониентращ ю испытуемого соединения,
которая обусловливает токсичность соединения V 50% клеток культур, обработанных при такой концентрации соединения.
Комплекс и соединения задерживают рост реновируса типа 2 при концентрации, равной
или меньщей 0,25 мг/мл, но в то же племя не
оказывают заметного токсического эффекта
на клетки ткантт культуры при дозах, в 10 раз
больших паименьщей активной дозы.
Сиродесмип А вводили через нос самкам и
сампам крыс в дозе 0,25 мг/мл в день в течение 14 дней. Все крысы выжили и после их смерти не было обнаружено никаких гистологических ненормальностей. При применении с целью достижепття антивирусного эффекта в присутствии клеток хозяина комплекс пли соединение давали хозяину в концентпапип, близкой к концентрации вируса, от 0.003 до 0.9.5 мг/мл. ДОПУСТИМО применение через нос или горло в дозах от 0,02
до 0.1 мг 3-6 раз в день. Для взрослых людей это эквивалентно дневной внутренней дозе от 2 до 20 мг.
Фармацевтические препараты могут быть изготовлены в форме таблеток, лепещек, капсул, носовых капель, жидкостей для впрыскивания в нос пли горло, аэрозолей или жидкостей для ингаляции; их можно приготовлять обычными способами с добавкой обычных индиЛферентных компонентов.
Предпочтительными являются композиции, обеспечивающие антивирусную концентрацию комплекса или соединения в тех органах хозяина, в которых обычно произрастают риновпрусы, пйпрпмер на слизистой оболочке носа или горла, при непосредственном нанесеНИИ на указанные места или косвенно путем образования достаточно высокой концентрации комплекса или соединения в крови после приема внутрь.
К таким предпочтительным композициям для непосредственного нанесения (например, в форме лепешки, которая медленно растворяется во рту и смачивает рот и связанные с ним пути раствором активного ингредиента) относятся композиции для ингаляции носа или горла в виде растворов антивирусного комплекса или соединения в фармацевтически допустимой жидкости, которая при ингаляции отлагается в носовых проходах и горле, а также композиции для приема внутрь, например, таблетки.
Эти таблетки или лепешки содержат от 0,05 до 5 мг антивирусного соединения; для профилактики или лечения вирусной инфекции таблетки прииимают от 3 до 6 раз в день. Состав для впрыскивлиия в нос или горло содержит от 0,01 до 1 мг антивирусного соединения в 1 мл раствора, и для профилактики или лечения риновирусной итгфекции 0,1 мл такого раствора впрыскивают в нос или горло 3-6 раз в день.
Комплекс, соединения или композиции можно применять профилактически для людей, которые могут соприкасаться с носителями риновирусной инфекции.
Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава (г): Нитрат натрия2,00
Первичный кислый фосфат калия1,00
Семиводный сульфат магния0,50
Хлорид калия0,50
Семиводный сульфат железа0,01
Декстроза («Церелоза)50,00
Дрожжевой экстракт («Оксоид) 1,00 Концентрат второстепенных элементов1,00 Затем готовят концентрат второстепенных элементов, содержащий (г):
Семиводный сульфат железа1,00
Пятиводный сульфат меди0,15
Семиводный сульф|ат цинка1,00
Четырехводный сульфат марганца 0,10 Молибдат калия0,10
Его растворяют в дистиллированной воде с добавлением концентрированной соляной кислоты в количестве, достаточном для получения прозрачного раствора, и разбавляют дистиллированной водой до 1 л.
К питательной среде добавляют Юн. раствор гидроокиси калия до рН 5,8 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин.
Sirodesmium diversum С.М. 1.102519 выращивают при 25°С в поверхностной культуре в 90 бутылках Томпсона, каждая из которых содержит 1 л питательной среды. Продукт собирают через 35 дней, и фильтрат культуры (70 л, рН 6,5) экстрагируют толуолом (2 раза по 14 л). Объединенные экстракты высущивают безводным сульфатом натрия и выпаривают при 60°С/20 мм. Остаток (7,1 г) промывают петролейным эфиром (т. кип. 60-80°С, 4 раза по 25 мл), промывную воду отбрасывают и получают антивирусный комплекс.
Пример 2. Антивирусный комплекс двух опытов примера 1 объединяют (6,52 г) и разделяют на 2 равные части. Каждую часть отдельно фракционируют на хроматографических колонках.
Через верх колонки добавляют экстракт в минимальном объеме смеси эфира и этилацетата (3:2), и колонку проявляют той же смесью растворителей до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет основания колонн. Каждую колонку разрезают на щесть равных секций, объединяют равноценные секции двух колонн и элюируют смесью этилацетата и метанола (97 : 3) 3 раза по 500 мл.
При выпаривании растворителей получают
6 фракций; 1-я фракция наименее полярная
и 6-я фракция наиболее полярная. Фракции
1-3 отбрасывают, фракция 4 содержит Сиродесмины А и С совместно с менее полярным
продуктом, фракция 5 содержит Сиродесмины
А, В и С совместно с нежелательным продуктом; фракция 6 содержит Сиродесмины В
совместно с основным продуктом.
Фракции 4-6 дополнительно разделяют методом хроматографии в тонком слое на силикагеле G, F. Для проявления используют следующие смеси растворителей: I - этилацетат и толуол (2: 1), II - муравьиная кислота, метанол и хлороформ (1 :4:95). Разделенные продукты выделяют при элюировании полос смесью этилацетата и метанола (97:3). При разделении хроматографией в тонком слое фракции 4 сухой колонки (780 мг, 8 пластин, растворитель I) получают фракцию (а) 92 мг (главным образом Сиродесмин А) и фракцию (б) 165 мг (главным образом Сиродесмины А и С). При дополнительном разделении фракции (а) тем же методом (одну ПиТастину проявляют дважды, растворитель II) получают фракцию (в) (43 мг, Сиродесмин А). При дополнительном разделении фракции (б) (2 пластины проявляют дважды, растворитель II) получают фракцию (г) (36,4 мг, Сиродесмин А и следы Сиродесмина С) и фракцию (д) (65 мг, Сиродесмин С. загрязненный следами Сиродесминов Аи Б), При разделении тем же методом фракции 5 сухой колонки (716 мг, 8 пластин, раствори-, тель I) получают фракцию (е) СЙОб мг, главным образом Сиродесмины А и С), при дополнительном разделении которой (6 пластин, растворитель II) получают фракцию (ж) (63,4 мг, главным образом Сиродесмин А) и фракцию (з) (146 мг, главным образом Сиродесмин С).
Фракции (г) и (ж) объединяют и дополнительно разделяют (2 пластины проявляют дважды, растворитель П) и получают фракцию (и) (37 мг, Сиродесмиц А). Фракции (в) и (и) объединяют и растворяют в бензоле (2 мл), а затем по каплям добавляют
к перемешиваемому раствору для осаждения твердого Сиродесмина А (68 мг).
Фракцию (з) дополнительно разделяют (1 пластину проявляют дважды, растворитель II) и получают фракцию (к) (68 мг, Сиродесмин С, загрязненный небольшими следами Сиродесминов А и В). Фракции (д) и (к) объединяют, растворяют в этилацетате (2 мл) и выделяют твердый Сиродесмин С (60 мг) при осаждении петролейным эфиром.
При разделении тем же методом фракции 6 сухой колонки (6 пластин, растворитель П) получают фракцию (л) (193 мг, масло, Сиродесмин В), из которой при обработке смесью бензола и петролейного эфира получают твердый Сиродесмин В (113 мг).
П р и м е р 3. Антивирусный комплекс (2,5 г), полученный из 90 л сброженного продукта, обрабатывают в безводном пиридине (50 мл) хлористым тионилом (5,0 мл) 15 мин при 0°С. Затем добавляют к смеси льда с водой (500 мл) и выдерживают дополнительно 15 мин. При добавлении 2н. серной кислоты устанавливают рН 2 и экстрагируют хлороформом (3 раза по 500 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия и концентрируют до получения масла (1,43 г), которое высушивают в «сухую колонку силикагеля (430 г), приготовленную следуюш.им образом: колбу емкостью 2 л, содержап1,ую силикагель (1 кг, силикагель М.Г.С. фирмы Хопкин и Виллиам) и воду (120 мл), вращают при комнатной температуре 2 час. Затем добавляют смесь этилацетата и толуола (2: 1) 112,5 мл, и колбу вращают еще 3 час. Колонку проявляют смесью винилацетата и толуола (2:1) и разделяют на 9 частей, каждую из которых элюируют смесью этилацетата и метанола (97 : 3) - 3 раза по 500 мл. Фракции, содержащие Сиродесмин А, объединяют и разделяют методом хроматографии в тонком слое (силикагель C.F., этилацетат : толуол 2 : 1) и получают чистый Сиродесмин А в виде масла (218 г).
Вторую партию промытого петролейным эфиром толуольного экстракта из 90 л перебродившего бульона обрабатывают таким же способом, и два образца Сиродесмина А (всего 505 МГ1 объединяют и растворяют в бензоле (5 мл). Твердый Сиродесмин А (358 мг) выпадает в осадок из раствора при добавлении по каплям петролейного эфира (т. кип. ).
Пример 4. Сиродесмин В (50 мг) в безводном пиридине (1,0 мл) обрабатывают хлористым тионилом (0,1 мг) в течение 12 мин при 0°С, добавляют смесь льда с водой (25мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 2 раствора, который затем экстрагируют хлороформом (3 раза по 20 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия, концентрируют до получения масла (29,4 мг), состоящего в основном из Сиродесмина А, но содержащего следы Сиродесминов В и С. Сырой продукт
очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле C.F. (растворитель муравьиная кислота - метанол - хлороформ 1 :4 :95) и получают Сиродесмин А в виде масла (12,5 мг).
Пример 5. Сиродесмин С (5,0 мг) в безводном пиридине (0,1 мл) обрабатывают хлористым тионилом (0,01 мл) в течение 10 мин при 0°С, добавляют к смеси льда с водой
(5 мл) и выдерживают 15 мин. При добавлении 2н. серной кислоты устанавливают рН 4 и экстрагируют хлороформом (3 раза по 5 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия, концентрируют и получают Сиродесмин А в виде масла (4,3 мг).
Пример 6. Проводят реакцию Сиродесмииа А (250 мг) с уксусным ангидридом (6,25 мл) в безводном пиридине при комнатной температуре в отсутствии света в течение
1 недели, а затем реакционную массу обрабатывают водой (1,25 мл) в течение 1 час при температуре 5°С. При добавлении 2 н. серной кислоты устанавливают рН 2, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (4 раза по
50 мл). Экстракты высушивают над сульфатом натрия и концентрируют до получения масла (280 мг), которое очищают на силикагеле методом хроматографии в тонком слое (растворитель муравьиная кислота - метаНОЛ - хлороформ 1 : 4 : 95).
Полученный основной компонент дважды перекристаллизовывают из смеси этилацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина А в форме игл светло-желтого цвета (127 MrV, т. пл. 186-189°С.
Пример 7. Раствор Сиродесмина А (50 мг1 и серы (15 мг) в пиридине (2 мл) выдерживают при комнатной температуре в темноте 24 час, а затем выпаривают досуха при температуре 35°С. Сиродесмины А, В и С получают при хроматографии - в тонком слое остатка (1 пластина силикагеля C.F., 40Х20Х XI см, растворитель этилацетат - толуол 2:1).
Пример 8. Культуру, выращенную, как описано в примере 1, собирают через 28 дней и фильтрат (70 л) экстрагируют хлороформом (2 раза по 14 л), высушивают над безводным сульфатом натрия, выпаривают при пониженном давлении и получают антивирусный комплекс. Взболтав толуол, метанол, хлороформ и воду при объемном соотношении 9:9:4:4, получают двухфазную систему (верхнюю и нижнюю). Полученный ранее
комплекс (15 г) растворяют в нижней фазе (300 мл), и этот раствор, а затем две дополнительные порции (300 мл) нижней фазы взбалтывают с верхней фазой (2 раза по 100 мл). Объединенные нижние фазы (900мл)
выпаривают досуха и остаток растворяют в нижней фазе (100 мл) второй двухфазной системы, приготовленной при взбалтывании иетролейного эфира (т. кип. 60--80°С), толуола, метанола и воды при объемном соотношении 2:3:4: 1. Этот раствор и вторую порII
цию нижней фазы второй двухфазной системы (100 мл) взбалтывают с верхней фазой (2 раза по 100 мл), и объединенные нижние фазы (200 мл) выпаривают досуха. Остаток (10 г) хроматографируют на дезактивном силикагеле (850 г), и элюированные фракции дополнительно очищают многократной хроматографией в тонком слое на силикагеле C.F.
Пример 9. К раствору очищенного комплекса (11 г), полученного как описано в примере 8, при разделении растворителями в пиридине (30 мл), добавляют холодный раствор двуокиси серы в пиридине. После выдержки в течение /2 час при комнатной температуре реакционную смесь выливают на лед и при добавлении 2 н. соляной кислоты (410 мл) устанавливают рН 2. Смесь экстрагируют хлороформом, экстракт промывают, высущивают и выпаривают. Получают остаток (8,9 г), который хроматографируют на дезактивном силикагеле.
Фракцию 2 очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле C.F., вначале применяя хлороформ - метанол - муравьиную кислоту (95:4:1) в качестве растворителя для выделения фракций с высоким и низким R(.
Фракции с низким Rf дополнительно очищают хромотографией в тонком слое, применяя этилацетат-хлороформ (7:3) в качестве растворителя, и получают Сиродесмин I.
Фракции с высоким Rf очищают хроматографией в тонком слое с применением в у.а честве растворителей хлороформа-метанола- муравьиной кислоты (95:4:1), а затем толуол-метилацетат (1:2) для получения Сиродесмина G.
Фракции 5 ц 6 объединяют, хроматографируют на колонке дезактивированного силикагеля (288 г) хлороформом и получают Сиродесмин А.
Пример 10. Остаток из хлороформенного экстракта, описанный в примере 9, (4,46 г) растворяют в метаноле (400 мл), содержащем концентрированную соляную кислоту (4 мл), и раствор выдерживают 40 час при комнатной температуре. Затем этот раствор выпаривают до 35 мл и добавляют воду (35 мл). Смесь экстрагируют смесью петролейного эфира (т. кип. 60-80°С) и толуола (2:3, 2 раза по 20 мл). Экстракты и часть нерастворимого вещества отбрасывают. Остальную водную фазу экстрагируют хлороформом, хлороформ испаряют и остаток разделяют на равные части.
Одну часть (1,15 г) хроматографируют на дезактивированном силикагеле. Остаток 3 фракции перекристаллизовывают из ацетона и получают дезацетилсиродесмин А, т. пл. 199-201°С. Другие части сырого продукта кристаллизуют из ацетона и получают дезацетилсиродесмин с температурой плавления 198-20 ГС.
Пример 11. К питательной среде, приготовленной, как онисано в примере 1, добавляют гидроокись калия в виде 10 н. раствора
12
до рН 5,6 и автоклавируют при давлении 0,7 кг/см 25 мин. Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 выращивают при температуре 25°С в конических колбах, содержащих по 150 мл среды, на вращающемся устройстве. Через 4 дня 12 мл бульона используют для инокуляции дополнительного количества колб, содержащих такое же количество той же среды. Через 12 дней роста в указанных условиях
собирают урожай. Установив рН 6,0, фильтрат (50 мл) дважды экстрагируют половинным объемом хлороформа. Объединенные экстракты выпаривают и получают антивирусный комплекс.
Пример 12. Sirodesmium diversum С.М. 1.102519 выращивают при температуре 25°С на вращающемся приспособлении; каждая колба содержит 1 л питательной среды, приготовленной, как онисано в примере 11.
Через 3 дня 3 л бульона используют для инокуляции 30 л питательной среды следующего состава (г):
Глицерин40,00
Питрат натрия2,21
Первичный кислый фосфат калия 5,00 Семиводный сульфат магния1,00
Дистиллированная водаДо 1,00 (л)
Питательную среду автоклавируют при давлении 1,05 кг/см в течение 25 мин, рН среды
не устанавливают; рН стерилизованной среды - 4,9.
Среда содержится в стеклянном и из нержавеющей стали бродильном чане. В последний подают стерильный воздух со скоростью
15 л/мин, и содержимое перемещивают турбкнной мещалкой со скоростью 380 об/мин бея применения перегородок. При необходимости добавляют противовспениватель пропилен - гликоль 750.
Через 15 дней устанавливают рН 6,0 (вм сто бывшего 6,7), фильтрат бульона экстрагируют хлороформом, затем хлороформ испаряют и получают антивирусный комплекс. Пример 13. Раствор Сиродесмина А
(0,083 г) в метаноле (100 мл), содержащий концентрированную соляную кислоту (1 мл), выдерживают в темноте при комнатной температуре 4 дня, а затем выпаривают досуха при температуре ниже 20°С. К остатку добавляют метанол, и раствор выпаривают до удаления следов HCL Остаток очищают хроматографией в тонком слое на силикагеле C.F., применяя хлороформ-метанол-муравьиную кислоту (95:4:1) в качестве растворителя, и
после перекристаллизации из смеси этилацетата и петролейного эфира получают дезацетилсиродесмин А с температурой плавления 198-201°С. Пример 14. Раствор Сиродесмина А
(0,15 г) и трифенилфосфина (0,078 г) в хлороформе выдерживают 4 час при комнатной температуре и выпаривают досуха. Остаток очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле С.Р., применяя хлороформ - метанол - муравьиную кислоту в качестве растворителя, и получают моносульфид Сиродссмина в форме геля. При осаждении его из раствора в этилацетате петролейным эфиром получают бесцветный порошок. Пример 15. Сиродесмин С (0,1 г) растворяют в метаноле (100 мл), содержащем концентрированную соляную кислоту (1 мл), и раствор выдерживают в течение 3 дней при комнатной температуре в темноте. Остаток, полученный после отгонки растворителя, очищают методом хроматографии в тонком слое на силикагеле C.F., применяя метанол-хлороформ в качестве растворителя для проявления, и после перекристаллизации из ацетона получают дезацетилсиродесмин С с температурой плавления ,5°С. Пример 16. Сиродесмин G (0,044 г) растворяют в смеси пиридина (2 мл) и уксусного ангидрида (1 мл), и раствор выдерживают в темноте при комнатной температуре 9 дней. Затем раствор охлаждают на соленом льду, добавляют холодную воду (0,4 мл), и смесь выдерживают 4 час. После добавления 3 н. серной кислоты (60 мл) смесь экстрагируют этилацетатом (3 раза по 25 мл), и объединенные экстракты промывают водой (50 мл), 5%-ным раствором бикарбоната натрия (2 раза по 50 мл) и снова водой (50 мл). Органический слой выпаривают, остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетата и петролейного эфира и получают бисацетат Сиродесмина G; т. пл. 159-159,5°С. Пример 17. Приготавливают раствор для пульверизации в полость носа, содержащий следующие компоненты (мг): Сиродесмин А6 Тимерозал2 Метиловый эфир параоксибензойной кислоты80 Пропиловый эфир параоксибензойной кислоты20 Фосфат натрия500 Динатриевая соль ЭДТК5 Дистиллированная вода (без пирогенов)До 100 (мл) Предмет изобретения Способ получения противовирусного комплекса, отличающийся тем, что культуру грибка штамма Sirodesmium diversum С. М. 1.102519 выращивают на среде, содержащей источники углерода и азота, экстрагируют фильтрат культуральной жидкости не смешивающимися с водой органическими растворителями, например хлороформом, высушивают экстракт и при необходимости фракционируют на активные компоненты.
