Способ диагностики завершения стадии яровизации озимой пшеницы Советский патент 1988 года по МПК A01G7/00 

00

о со

00

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к растениеводству, и мбжет быть использовано для диагностики завершения стадии яровизации как в практике фитотронии, так и при производственном выращивании озимой пшеницы в случае необходимости установления факта прохождения стадии яровизации после неблагоприятных осенне-зимних условий для роста и развития озимых растений при решении вопроса о целесообразности пересева после перезимовки ослабленных вследствие осенней засухи посевов. Ранняя диагностика окончания либо незавершения стадии яровизации при производственных посевах позволяет ускорить пересев и испольт зовать при этом лучше весеннюю влагу.

В фитотронии тестирование завершения срока яровизации позволяет значительно (на 40%) уменьшить время эксплуатации климатических камер в научно-исследовательских учреждениях, что обеспечивает существенную экономию электроэнергии и расходы по техническому обслуживанию фитотрона.

Целью изобретения является повышение эффективности способа за счет возможности ранней и быстрой диагностики завершения срока яровизации и сокращение сроков ее определения.

На фиг. 1 изображена кинетика поглощения НАМД тканями меристем главного стебля озимой пшеницы Мироновская 808; на фиг. 2 - зависимость поглощения НАМД тканями меристем главного стебля от его концентрации.

В основу изобретения взято свойство хроматина изменить свою конформацию и характер белково-нуклеинового взаимодействия, связанного с изменением активности определенных генов при переключении программы онтогенеза растений. Транскрипционную активность хроматина оценивали по способности ДНК образовывать комплексы с антибиотиком актиномицином Д. Актиноми- цин Д обладает высокой избирательностью действия, образуя комплексы с гуаминовы- ми основаниями ДНК, более доступными благодаря разной степени конденсации надмолекулярной структуры ДНК, в которой отражена транскрипционная активность генетического аппарата клеток. Поэтому регистрация уровня связывания актиномицина Д с ДНК хроматина позволяет количественно тестировать транскрипционную активность выделяемого из тканей растения дезокси- рибонуклеопротеида.

Способ осуществляется следующим образом.

Из 7-10 опытных растений на разных этапах яровизации изолируют конус нарастания в основном побеге вместе с отрезком прилегающего листа длиной около 1 мм (изоляция конуса нарастания занимает больше времени, чем отрезание ко

0

5

нуса вместе с кусочком листа, а на конечный результат это не влияет). Изолированные части растений помещают в водный раствор с меченым по тритию Н-ак- тиномицином Д (НАМД) при концентрации раствора 30 мкг/мл и удельной радиоактивности 1 мкКи в миллилитре на 0,5-1 ч при комнатной температуре. После экспозиции образцы промывают проточной холодной водопроводной водой, гомогенизируют, осаждают двойным объемом 20%-ной три- хлоруксусной кислоты (ТХУ) и определяют радиоактивность нерастворимого осадка в кислоте осадка на сцинтилляционном счетчике. Поскольку НАМД специфически взаимодействует в основном с гуаниновыми основаниями ДНК, а при осаждении ТХУ

в осадке содержится ДНК, РНК и белки, то основное количество включенной радиоактивности приходится на ДНК. Измеренная радиоактивность отражает транскрипционную (относительную) хроматина яровизированных растений и сравниваем ее с активностью неяровизированных растений для установления факта завершения процесса яровизации. По соотношению транскрипционных активностей яровизированных и неяровизированных растений судят о моменте завершения яровизации, считая завершившими яровизацию те растения, у которых наблюдается резкое увеличние этого соотношения.

Установлено, что после завершения процесса яровизации активность хроматина, тестируемая по уровню комплексооб- разования с актиномицином Д, резко повышается по сравнению с транскрипционной активностью хроматина неяровизированных растений.

Пример. Из сортов озимых пшениц Мироновская 808, Ильичевка, Безостая - 1 на разных этапах яровизации (через каждые 10 сут), и контрольных растений (неяро- 0 визированных), а также у ярового сорта Ред-Ривер-68 произвольно отбирали 7-10 растений (метод позволяет использовать и меньшее количество растений, что. важно при селекционной работе), изолировали конус нарастания с отрезком листа около 1 мм. Образцы помещали на 0,5-1 ч в водный раствор с меченым по тритию актиномицином Д. Концентрация антибиотика - 30 мкг/мл; удельная радиоактивность - 1 мкКи/мл. Оптимум концентрации и длительность экспозиции установлены экспериментально (см. фиг. 1 и 2).

После экспозиции образцы промывали водопроводной водой, гомогенизировали с водой (1:1 - навеска:вода), добавляли раствор 20%-ной ТХУ до конечной концентрации 10% ТХУ. Полученные осадки переносили на нитроцеллюлозные фильтры, промывали сначала раствором 5%, затем водой, высушивали на воздухе и определяли

0

5

0

5

радиоактивность на сцинтилляционном счетчике. Вся процедура заняла 2-3 ч.

Яровизацию растений указанных сортов озимых пшениц проводили путем выдерживания растений при 1-3°С в течение определенного времени, а именно 60 дн, и через каждые 10 сут отбирали пробы для определения транскрипционной активности указанным способом.

В табл. 1 приведены сравнительные данные определения момента завершения стадии яровизации согласно предлагаемому способу у растений, яровизированных с помощью низких температур, и неяровизированных растений.

Из приведенных в табл. 1 данных видно, что . максимальная транскрипционная активность наблюдалась, начиная с 30-го дня яровизации растений. Этот период оказался достаточным для того, чтобы растения выколосились.

Если сравнить транскрипционную активность хроматина у яровизированных и неяровизированных растений, то оказывается, что момент завершения стадии яровизации наступает, когда резко увеличивается соотношение транскрипционных активностей у яровизированных к неяровизированным растениям.

В табл. 2 представлено соотношение транскрипционных активностей яровизированных к неяровизированным растениям (отношение радиоактивности кислотонерастворимого осадка у яровизированных растений к неяровизированным).

Так, у неяровизированных растений сорта Мироновская 808 транскрипционная активность, тестируемая по интенсивности связывания актиномицина Д, составляет бОмп/мин мг . При яровизации растений до 20 дн включительно резкого повышения транскрипционной активности не обнаружено (соотношение транскрипционной активности яровизированных растений к неяровизированным сортам Мироновская 808, прошедших яровизацию в течение 10 дн, составляет 71:60 1,18; 20 дн - 51:60 0,85). При более длительном выдерживании растений при низких температурах происходит скачкообразное повышение этого показателя (30 дн - 257:60 4,25; 40 дн - 168:60 2, 80; 60 дн - 171:60 2,86).

Для сорта Безостая-1 соотношение транскрипционных активностей яровизированных растений при низких температурах к неяровизированным составляло: после 10 дн.- 1,28; 20 дн - 1,19; 30 дн - 4,5; 40 дн - 3,40; 50 дн - 3,68; 60 дн - 3,35;. Аналогичные данные получены и для других

сортов.

Таким образом, резкое повышение транскрипционной активности хроматина у завершивших яровизацию растений можно.расценивать, как переключение программы онтогенеза.

Преимущества предлагаемого способа заключается в следующем.

Значительное сокращение времени тестирования - 2-3 ч (быстрая оценка селекционного материала на продолжитель5 ность яровизации дает возможность на ранних этапах выявлять высокозимостойкие, длинностадийные формы).

Раннее определение срока завершения процесса яровизации в климатических камерах приводит к освобождению площади,

0 эксплуатация которой составляет 300 руб на 1 м за 30 дн (возможность ранней оценки производственных посевов позволяет своевременно решить вопрос о необходимости пересева при неблагоприятных условиях осен5 ней вегетации после перезимовки и т.е. поднять урожайность зерновых культур на 4-5 ц/га).

Минимальное количество аналитического материала для определения окончания момента завершения стадии яровизации (точки

0 роста из 7-10 растений), а при необходимости анализа уникальных селекционных форм можно ограничиться одним растением или одной точкой роста.

Формула изобретения

Способ диагностики завершения стадии яровизации озимой пшеницы, включающий отбор и анализ растений на биохимический показатель, значение которого связано с завершением стадии яровизации, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа и сокращения сроков определения, в качестве биохимического показателя используют транскрипционные активности хроматина, которые определяют в айикальных отрезках основных побегов растений, вычисляют соотнощение данного показателя у яровизированных и неяровизированных растений, считая завершившими стадию яровизации те растения, у которых это соотношение составляет 2,8-4,9.

Таблица 1

Изобретение относится к сельскому хозяйству. Цель изобретения - повышение эффективности способа и сокращение сроков определения. Из анализируемых растений вычленяют отрезки с конусом нарастания в основном побеге, определяют в них транскрипционную активность хроматина. По соотношению транскрипционных активностей яровизированных и неяровизированных растений судят о моменте завершения яровизации, считая заверц1ившими яровизацию те растения, у которых это соотношение составляет 2,8-4,9. Резкое повышение транскрипционной активности хроматина у завершивших яровизацию растений можно расценивать как переключение .программы онтогенеза. 2 ил., 2 табл. (в

49 -351+044+1244 + 3207+49204+19209 + 35

60+371+451+4257+44199+63168+29172+45

54±554t1463+9249+42. 209+45168+19194+39

5- +474+968+14260+90194+48210+24191 + 45

1,04 0,894,974,284,164,26

1,18

0,854,28 3,312,802,86

11,164,613,873,113,59

1,291,194,56 3,403,683,35

Таблица 2