Способ определения морозоустойчивости пшеницы Советский патент 1989 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности селекции сельскохозяйственных растений, а также экспериментальной биологии и может быть использовано для определения морозоустойчивости пшеницы.

Цель изобретения - повышение достоверности и точности анализа, а также сокращение времени определения .

Способ включает проращивание зерновок, воздействие низкой температурой и цитофотометрический анализ на содержание ДНК в ядрах меристемы, при этом на четырехсуточные проростки последовательно воздействуют пониженной температурой +4 и -4°С, затем вьщеляют апикальные меристемы побегов, окраиивают их по Фельгену, готовят давленые препараты, проводят цитофотометрический анализ при 550 нм и по соотношению количества ДНК в ус- ТОЙ1ШВЫХ фазах клеточного цикла (G,+

+ S) и чувствительной к действию низ ких температур фазе (С) судят о степени морозоустойчивости.

Важным моментом способа является выбор в качестве объекта исследования апикальной меристемы побега. Апикальная меристема побега более чутко реагирует на снижение температуры по сравнению с корнем, которьпЧ в естественных условиях находится в почве, поэтому его чувствительность на низкие тe fflepaтypы невысока. Апикальная меристема побега является главной среди образовательных тканей, она обеспечивает морфогенез растения, дифференцировку тканей, регулирует клеточный цикл. Изменение фазового состояния апикальной меристемы побега при снижении температуры может служить критерием степени устойчивости растений.

При низких температурах у проли- ферирующих клеток затормаживаются

сл

ел го

ос

со со

ел

жизненные процессы, наблюдается за- тухание деления, основная масса клеток находится в интерфазе - наиболее продолжительной фазе митоти- ческого iijiKJia. Интегральную оптическую плотность окрашенных по Фельге- ну интерфазных ядер измеряют в трех фазах: в пресинтетической фазе. ((,), в которой идет подготовка клетки к синтезу JIHK; в синтетической фазе (S), когда осуществляется синтез . ДНК; в постсинтетической фазе (С,,), в течение которой клетка переходит к делению.

Ядра соматических клеток пред- синтетической фазы характеризуются диплоидным количеством ДНК (2С), ядра постсинтетической фазы - тет- раплоидньпч количеством ДРЖ (4С) , ядра синтетической фазы - промежуточным количеством (2С - 4С) .

Критерием диплоидного количества ДНК служат телофазные ядра, находящиеся в процессе деления, которые содержат 2С ДНК, а тетраплоидного - метафазные ядра, содержа1Цие 4С ДНК.

Учитываются как наиболее устойчивые фазы - предсинтетическая и синтетическая (G иS), так и самая чувствительная постсинтетическая (G) (Гродзинский Д.М., Хилько Т.Д-. , Беле1щая Е.К. Критика клеточной популяции меристемы стебля озимой пшеницы после действия отрицательной температуры. - В кн.: Клеточньм |цикл растений, Киев, 1983).

Выбор пониженных температур в наш1гх опытах соответствует прохож- 1дению растениями I фазы закалива- иия (+4°С) и II фазы закаливания (-4°С) в естественных условиях.

Способ осуществляют следующим образом.

Зерновки разных сортов пшеницы,

20

Интегральную оптическую плотность окрашенных ядер измеряют на сканирующем 1штоспектрофотометре СМП-03.

с Для анализа отбирают 60-70 ядер в каждом варианте. Коэффициент морозоустойчивости рассчитывают как отношение количества ДНК в ядрах в фазах G, и S к их количеству в фазе Gj.

g Выбранный режим проращивания можно обосновать следующим образом. На четвертые сутки в апикальной меристеме побега наблюдается наибольшее количество митозов (делящихся клеток),

15 У трехсуточньк-проростков митоз наблюдается, но в очень незначительной степени и на давленых препаратах почти не виден, у пятисуточных проростков наблюдаются следующие волны митоза и помимо удлинения cpoKoiJ анаг- .тиза, что нецелесообразно, падает также достоверность получаемых результатов.

Кроме того, температурный режим

25 и режим проращивания выбран в соответствии с фазами закаливания. Первая фаза закаливания находится в интервале , вторая - -2 до . Температурньш режим и время выдержки установлены эмпирически.

Примеры 1-4. Зерновки сортов озимой пшеницы - Ульяновка (высокоморозоустойчивый сорт), Мироновская 808 (морозоустойчивый сорт),

35 Карлик краснодарский (среднеморозо- устойчивый сорт), Московская 35 (неморозоустойчивый сорт) - проращивают последовательно 4 сут при 20°С, -затем 4 сут при 4°С, 2 сут при -4°С

40 и 1 сут при +4°С. После прохождения цикла понижающихся температур из ггроросткоЕ выделяют клетки апикальной меристемы побега и фиксируют их в смеси этанол-уксусная кислота (3:1)

различалопшхся по степени морозоустой- в течение 3 ч при 4 С. Материал проводят последовательно через серию спиртов различной концентрации до воды (70, 50, 30%, вода). Образцы подвергают гидролизу в 1 н.НС в те- 5Q чение 40 мин при 50°С, окрашивают реактивом Шиффа (при 4 С в течение 6 ч), получая при этом окрашенные в густо-фиолетовый цвет комплексы ДНК- фуксина . Не вошедший в реакцию крачивости, прораищвают при 20°С, а затем последовательно выдерживают при 4 и -4°С. После прохождения цикла низких температур из проростков выделяют 8-10 меристем побега и фиксируют их в смеси этанол-уксусная кислота. Образцы подвергают гидролизу в 1 н.НС, окрапшвают реактивом Шиффа (фунсинсернистая кислота), ко

Интегральную оптическую плотность окрашенных ядер измеряют на сканирующем 1штоспектрофотометре СМП-03.

Для анализа отбирают 60-70 ядер в каждом варианте. Коэффициент морозоустойчивости рассчитывают как отношение количества ДНК в ядрах в фазах G, и S к их количеству в фазе Gj.

Выбранный режим проращивания можно обосновать следующим образом. На четвертые сутки в апикальной меристеме побега наблюдается наибольшее количество митозов (делящихся клеток),

У трехсуточньк-проростков митоз наблюдается, но в очень незначительной степени и на давленых препаратах почти не виден, у пятисуточных проростков наблюдаются следующие волны митоза и помимо удлинения cpoKoiJ анаг- .тиза, что нецелесообразно, падает также достоверность получаемых результатов.

Кроме того, температурный режим

и режим проращивания выбран в соответствии с фазами закаливания. Первая фаза закаливания находится в интервале , вторая - -2 до . Температурньш режим и время выдержки установлены эмпирически.

Примеры 1-4. Зерновки сортов озимой пшеницы - Ульяновка (высокоморозоустойчивый сорт), Мироновская 808 (морозоустойчивый сорт),

Карлик краснодарский (среднеморозо- устойчивый сорт), Московская 35 (неморозоустойчивый сорт) - проращивают последовательно 4 сут при 20°С, -затем 4 сут при 4°С, 2 сут при -4°С

и 1 сут при +4°С. После прохождения цикла понижающихся температур из ггроросткоЕ выделяют клетки апикальной меристемы побега и фиксируют их в смеси этанол-уксусная кислота (3:1)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции пшеницы при создании морозоустойчивых сортов. Целью изобретения является повышение достоверности и точности при сокращении времени определения морозоустойчивых растений. Растения последовательно подвергают обработке температурами, соответствующими первой и второй фазами закаливания, затем из апикальных меристем готовят давленые препараты, окрашенные по Фельгену, и определяют соотношение ДНК в фазах клеточного цикла G₁+S и G₂ фазе. 1 табл.

торый взаимодействует с ДНК, образуя отмывают в свежих сернистых

окрашенный в густо-фиолетовый цветводах, обрабатьшают 0,2%-ным раствокo 1плeкc /ШК-фуксин, по содержаниюРом целлюлизина для удаления кпеточкоторого п ядре судят о суммарном ко-ных оболочек, мацерируют в 40%-но

личестве ДИК,уксусной кислоте и готовят постоянные

препараты с помощью жидкого азота и бальзама.

Интегральную оптическую плотности окрашенных ядер измеряют на сканирующем цитоспектрофотометре СПМ-03. Коэффициент морозоустойчивости рассчитывают как. отношение количества ДНК в ядрах в фазах G, и S к их количеству в фазе G.

Полученные данные представлены в таблице.

Для доказательства существенности режима выращивания проростков проведены сравнительные опыты 5-7, в которых используют режим вьфащивания по прототипу.

Примеры 5-7 (сравнительные Зерновки пшеницы сортов Мироновская 808, Безостая 1, Московская 35 проращивают раздельно 10 сут при 4°С и 27 ч при 20 С. Отделяют кончики корешков (1-1,5 мм) и далее следуют методике, приведенной в примерах 1-4. Коэффициент морозоустойчивости рассчитьшают по отношению содержания ДНК в ядрах клеток, вьфащенных при 20 и .

Полученные данные представлены в таблице.

Предлагаемый способ позволяет более четко разделять близкие по морозоустойчивости сорта (морозоустойчивый сорт Мироновская 808 отличается от высокоморозоустойчивого сорта Ульяновка в 1,7-1,8 раза, тогда как по известному способу это различие составляет всего 0,1); сократить время проведения анализа и объем

Суммарное содержание ДНК-фуксина в ядрах апикальной меристены побега в зявисимостн от сорта и коэффициента морозоустойчивости

исследуемого материала (по сравнению с способом-гфототипом) более чем вдвое, так как для пмчислемия коэффициента морозоустойчивости используют растения одного режима выращивания вместо двух. Достоверность определения повышается за счет того, что для анализа берется апикальная меристема побега, фазовое состояние которой более специфично на влияние низких температур чем у корневой меристемы.

15 Формула изобретения

0

Способ определения морозоустойчивости пшеницы, включающий проращивание зерновок, воздействие низкой температурой, цитофотометрический анализ на содержание ДНК в ядрах мери- стег-1ы, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения точности и достоверности анализа, а также сокращения времени определения, на четы- рехсуточные проростки последовательно воздействуют пониженной температурой, соответствующей температурам первой и второй фаз закаливания, затем выделяют апикальные меристемы побегов, окрашивают их по Фельгену, готовят давленые препараты, проводят цитофотометрический анализ при длине волны, соответствующей максимальному поглощению излучения реактива Шифа и по соотношению количества ДНК в устойчивых фазах точного цикла и чувствительной к действию низких температур фазе судят о степени морозоустойчивости .

5

0

5