Способ определения концентрации микроорганизмов в суспензиях Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/00 

СО

00

1ЧЭ

00

00

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при иммунофлуоресцентном анализе микроорганизмов.

Целью изобретения является повышение достоверности способа и сокращение времени определения.

Способ заключается в том, что в суспензию клеток добавляют специфи- ческий люминесцирующий иммуноглобулин, полученную смесь вводят в гель, микрообъем смеси наносят на предметное стекло, выдерживают до начала по лимеризации, накрывают покровным стеклом и выдерживают до затвердевания без образования пустот и подсчитывают число микроорганизмов (кл/мл) по формуле

S-, М а

N

So. 25-V

-1 e

flp

где S

OK

площадь покровного стекла,

мм ,

площадь окулярной сетки, приведенная к увеличению

объектива, мм

г.

пр

а

I 25 - число полей зрения; М - число клеток в 25 полях зрения каждого образца; У„„ - микрообъем смеси для одного образца, мм; число разведенной суспензии;

погреиность результата из 10 образцов.

Пример 1. Определение концентрации клеток BiSubfills в суточной бульонной культуре.

Суточную культуру В.SU bf i1 is, выращенную в мясопептонном бульоне, объемом 3. МП помещают в кювету (толщиной 1 см) спектрофотометра и измеряют плотность на длине волны 600 нм, величина которой составляет больще 3 ед.оптической плотности. Культуру разводят физиологическим раствором {0,85%-ным NaCl) в 20 раз и измеряют оптическую плотность, которая составляет 0,36 ед. оптической плотности. К 3 мл полученной суспензии добавляют 0,375 мл люминесцирующего иммуноглобулина, специфического к В, sub- fllis разведена 1:8. После проведения (15 мин) иммунофлуоресцентной реакции в полученную смесь добавляют 0,3 мл дезоксихолата (0,3 мг/мл), переворачивают закрытую пробирку несколько раз без образования пены.

0,3 мл полученной смеси добавляют к 2,7 мл геля-. Затем на обезжиренное предметное стекло наносят по две капли смеси по 3 мкл, после 3 мин выдерживания кйждую каплю накрывают покровным стеклом 0,15 мл размером 16x16 мм. Подсчет клеток проводят на микроскопе в 25 полях зрения на пяти мазках: 90,0, 89, 87, 100, 82. Ср еднее число клеток составляет (в 25 полях зрения) М 91+3. Концентрация В,subfi1fs

So« 25-V,

±е (7,5+0,2)

пр

х10 кл/мл.

Время анализа 30-40 мин.

Пример 2. Подсчет клеток кишечной палочки Ml 7 в препарате Бификол.

4,5 мл неразведенной суспензии препарата Бификол, содержащего клетки кишечной палочки Ml 7 ибифидобакте- рии, соединяют с 0,6 мл люминесциру- ющего иммуноглобулина, специфического к кищечной палочке разведения 1:8. После проведения иммунофлуоресцентной реакции 15 мин в полученную смесь добавляют 0,45 мл дезоксихолата (0,3 мг/мл), несколько раз (герметично закрытую) пробирку переворачивают без образования пены, 4,2 мл полученной суспензии добавляют в используемый в данном случае полиакриламид- ный гель вместо дистиллированной воды. Затем на обезжиренное стекло наносят 2 капли смеси по 3 мкл, после 3 мин выдерживания каждую каплю накрывают покровным стеклом толщиной 0,15 мм, под которым через 7 мин образовывается застеклованная проба, занимающая камеру размером 16x16x0, ОПОЗ мм. Подсчет клеток проводят на микроскопе в 25 полях зрения на шести мазках: 15, 20, 17, 16, 13, 16. Среднее число клеток в 25 полях зрения мазков М 15±2. Концентрация кищечной палочки Ml 7 в препарате Бификол

N

± (1,7-0,2)

So. 10 кл/МП.

Время анализа 30-40 мин.

Клетки бифидобактерий не мешают количественной оценке клеток кишечной палочки из-за специфического окрашивания только клеток кишечной палочки.

Пример 3. Подсчет общего числа микроорганизмов в препарате Бифи- кол с помощью неспецифического окра- щивания клеток микроорганизмов.

4,5 мл неразведенной суспензии препарата Бификол смешивают с 0,5 мп ФИТЦ (флуоресцеин изотиоцианат изомер ). Исходный раствор ФИТЦ 1 MI-мл рН 8,0 инкубируют 10 мин. К полученной смеси добавляют 0,45 мл дезокси- холата (0,3 мг/мл). 4,2 полученной суспензии добавляют в используемый в данном случае полиакриламидный гель вместо дистиллированной воды. Затем на обезжиренное стекло наносят по 2 капли смеси по 3 мкл. После 3 мин выдерживания каждую каплю накрывают покровным стеклом толщиной 0,15 мм размером 16x16 мм. Подсчет клеток проводят на микроскопе в 25 полях зрения на шести мазках: 86, 95, 87, 101, 91. Среднее число клеток в 25 полях зрения мазков М

± f (1,02 ± Ъок /J у„,

Пр

91+4. N

+ 0,04) -10 кл/мл.

Время анализа 30-40 мин.

Используемый гель должен удовлетворять следующим условиям: не обладать собственной люминесценцией при возбуждении в диапазоне длин волн 400-500 нм, не тушить люминесценцию красителя, образовывать после полимеризации прозрачное стекловидное тело, не должен содержать посторонних включений, образование застекло ванного тела должно заканчиваться в течение 7-10 мин.

Таким требованиям отвечает, например, полиакриламидный гель, состящий из акриловой кислоты амид (СН2 CHCONH ,), персульфата аммония (NN4) )1 додецилсерной кислоты натриевая соль ДЦС (СН з(СН2)т050эМа N ,N -метилен-бис-акриламида (ОН 2(NHOCCH CH ) N,N,N N -тетраме тилэтилендиамина ((CHj) (СН ), трис-(оксиметил)-аминометана (NH СССН-гОН) з) , а также трис-(окси- метил)-аминометан гидрохлорида (NH2C(CH20H) jHCl.

Для работы готовят раствор А: в 25 мл дистиллированной воды растворяют 1,85 г трис-НС1, 7,7 г трис- ОН, 0,2 г ДДС, после растворения объем доводят до 50 мл; раствор В: в 50 мл дистиллированной воды раст0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

воряют 14,6 г акриламида, 0,4 г бис-акриламида; раствор С: готовый раствор ТЭМЭД (N ,N ,М , N -тетраметил- этилендиамин); раствор D: в 2 мл дистиллированной воды растворяют 200 мг персульфата аммония.

Для приготовления геля смешивают растворы А, В, Ci D в следующем порядке: 2,5 мл раствора А, 3,3 мл раствора В, доводят дистлиллирован- ной водой до 10 МП, 5 мкл раствора С, 50 мкл раствора D.

Концентрация клеток после суммарного разведения Неисходной суспент

зии

П П,,

где П - разведение исходной суспензии фосфатным буфером до 0,„„ 0,2-0,5;

П - разведение люминесцирующим иммуноглобулином; разведение дезоксихолатом;

Пз П - разведение гелем,

должна составлять 5 40 , ... 10 кл/мл.

Изобретение может быть использовано при нормировании приборов, предназначенных для счета клеток в суспензиях, концентраторов, приборов, используемых для контроля загрязнений окружающей среды микробиологическими предприятиями. Кроме того, соб может быть использован для определения количественного и качественного составов клеточных суспензий в готовых формах вакцин и препаратов.

Формула изобретения

Способ определения концентрации микроорганизмов в суспензии, предусматривающий окрашивание ее, разбавление, фиксирование клеток к среде, нанесение суспензии на предметное стекло с последующим микроскопировани ем, отличающийся тем, что, с целью повьппения достоверности способа и сокращения времени определения, суспензию клеток разбавляют физиологическим раствором, содержащим 0,85%-ный хлористый натрий, до концентрации 10 - 10 кл/мл, добавляют люминесцирующий иммуноглобулин, специфический к данному микроорганизму, и полученную смесь инкубируют до завершения иммунофлюоресцентвой реакции, добавляют к ней дезоксихолат

513828Д86

и полимерный гель, а перед микроско- ла полимеризации, накрывают покров- пированием смесь, нанесенную на пред- ным стеклом и выдерживают до затвер- метное стекло, выдерживают до нача- девания.