Способ экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах Российский патент 2021 года по МПК G01N33/12 

Изобретение относится к микробиологии, точнее к способу экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах, способных формировать колонии и вызывать болезни пищевого происхождения у потребителя, и может быть использован в государственных лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизы (ГЛВСЭ) на предприятиях по переработке и хранению продуктов животноводства, на продовольственных рынках, в бактериологических лабораториях предприятий пищевой промышленности, сельского хозяйства, медицины, экологии, в научно-исследовательских учреждениях для существенного сокращения времени на исследование и получения достоверных результатов о присутствии/отсутствии микроорганизмов.

Известен метод определения контаминации мяса и мясных продуктов мезофильными аэробными и факультативно анаэробными микроорганизмами (МАФАнМ). В соответствии с ГОСТ 10444.15-94 для определения КМАФАнМ проводят посевы на мясопептонный агар с глюкозой и дрожжевым экстрактом, а также на другие агаризованные питательные среды отечественного и зарубежного производства [1].

Недостатками метода являются длительность получения результатов посевов (до 48-72 ч), большое количество методических манипуляций, лабораторной посуды, питательных сред, неточность цифровых показателей жизнеспособных бактерий, т.к. выросшие колонии (колониеобразующие единицы, КОЕ/мл) могут формироваться не из одной, а из нескольких бактериальных клеток.

Также наиболее близким к предлагаемому способу является микроскопический анализ мяса согласно ГОСТ 31931-2012 «Мясо птицы. Методы гистологического и микроскопического анализа», который включает приготовление мазков-отпечатков из поверхностных и глубинных слоев исследуемой пробы, окрашивание методом Грама и микроскопирование в световом микроскопе [4].

Недостатком данного метода является невозможность определить точное количество опасных жизнеспособных (живых) микроорганизмов - контаминантов мяса и мясных продуктов, способных через 48-72 ч формировать колонии и стать причиной возникновения болезней пищевого происхождения.

Целью изобретения является существенное (до 2 суток) сокращение времени проведения микробиологического и микроскопического анализа мяса и мясных продуктов с точным подсчетом жизнеспособных (живых) контаминантов в образцах продукции и обеспечение длительного хранения результатов в электронном виде.

Поставленная цель достигается тем, что для экспресс-детекции общего количества жизнеспособных микроорганизмов (КМАФАнМ) в мясе и мясных продуктах используется метод выявления контаминирующих бактериальных клеток в образцах продукции, окрашенных двухкомпонентным красителем Live/Dead (Backlight™), который позволяет непосредственно определить живые клетки при люминесцентном микроскопировании с последующим фотографированием и архивированием результатов в компьютере как отчетную, технологическую и юридическую документацию.

Способ является оригинальным, простым в методическом проведении, визуально информативным, позволяет существенно сократить время исследования (с 48-72 ч до 3-5 ч), получить достоверные результаты о присутствии/отсутствии микроорганизмов вследствие использования коммерческого стандартного красителя Live/Dead (Backlight™), уменьшить количество лабораторной посуды, исключить применение дорогостоящих питательных сред, а также архивировать результаты в компьютере как отчетную, технологическую, а также юридическую документацию. Способ поясняется информацией в таблице (см. таблицу).

Изобретение поясняется следующими фигурами.

Фигура 1. Микроорганизмы в полях зрения люминесцентного микроскопа ×320 - в образце из суспензии (супернатанта).

Фигура 2. Микроорганизмы в полях зрения люминесцентного микроскопа ×320 - в мазке из осадка.

Фигура 3. Микроорганизмы в полях зрения люминесцентного микроскопа ×320 - в мазке из осадка.

Экспресс-способ включает: отбор проб мяса и мясных продуктов, подготовка навески продукта, приготовление суспензий и препаратов из нее методом «раздавленная капля» и мазка из осадка [6, 7], разведение исходного раствора 2-х компонентного флуоресцентного красителя Live/Dead (Backlight™) (смесь йодистого пропидия с витальным красителем SYTU9) до рабочего разведения 1:10, окрашивание подготовленных препаратов с помощью флуоресцентного красителя, экспозиция в темноте смешанных с красителем образцов в течение 10-15 мин при температуре 20-30°С, просмотр препаратов в люминесцентном микроскопе с синим светофильтром при увеличении не менее ×320, проведение фотосъемки неспециализированным фотоаппаратом общего назначения с архивированием в компьютере, подсчет на фото живых (зеленых) и мертвых (оранжево-красных) бактериальных клеток в нескольких полях зрения, определение среднего количества живых микроорганизмов исследуемого образца с заключением о возможности/невозможности использования мяса и мясного продукта в пищевых целях.

Способ основан на определении жизнеспособных клеток микроорганизмов путем окраски препаратов из образцов различной консистенции (суспензий и мясного осадка) (фиг. 1-3), приготовленных в 0,9% физиологическом растворе с помощью флуоресцентного красителя Live/Dead (Backlight™) с последующим микроскопированием и фотосъемкой фотоаппаратом без вспышки в режиме, повышающем контрастность, архивировании в компьютере, подсчетом живых (зеленых) и мертвых (оранжево-красных) клеток бактерий, определением средней величины путем сложения количества живых клеток в нескольких полях зрения исследуемого образца и деления его на число полей и заключением о возможности/невозможности использования потребителем. Архивированные в компьютере результаты позволяют использовать их как отчетную, технологическую, юридическую документацию.

Пример 1. Для проведения исследований отбор и подготовку проб из мяса птицы и птицепродуктов проводят согласно ГОСТ Р 50396.0-2013 [5]. Анализ мяса и мясных продуктов проводят по ГОСТ Р 54354-2011 [3].

Поверхность анализируемых птицепродуктов стерилизуют раскаленным шпателем или обжигают тампоном, смоченным в этиловом спирте, вырезают стерильными ножницами кусочки небольших размеров массой 1-1,5 г из разных участков поверхностных и глубинных слоев продукта. Масса объединенной пробы должна составлять 20-30 г. Затем пробу измельчают в стерильной ступке или с помощью гомогенизатора со стерильной емкостью. В стерильную центрифужную пробирку отбирают 1 г исследуемого субстрата и заливают 9 мл физиологического раствора.

Смесь перемешивают на вортексе (мешалке) в течение 30-60 сек, затем пробирку переносят в центрифугу с режимом работы 10 тыс. об/мин в течение 5-8 мин. При меньшем количестве оборотов (например, 5 тыс. об/мин) центрифугирование выполняют в течение 10-15 мин. Дальнейшему анализу подвергают как супернатант (надосадочная жидкость), так и осадок.

Для обнаружения микробных клеток в супернатанте готовят препарат методом «раздавленной капли»: на 3 чистых предметных стекла наносят 2 капли (по 7 мкл) супернатанта, добавляют 1,5 мкл рабочего раствора флуоресцентного красителя Live/Dead (Backlight™) (разведение в дистиллированной воде 1:10), накрывают покровным стеклом и выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Такое же соотношение реагентов сохраняется при изучении препаратов из осадка центрифугированной суспензии. Для этого на 3 чистых предметных стекла наносят бактериологической петлей взвесь из осадка, осторожно растирают тонким слоем размером 1,5-2 см. На одном предметном стекле готовят 2 мазка. Возможно растирание материала по стеклу покровным стеклом. Затем препарат окрашивают 1,5 мкл рабочего раствора флуоресцентного красителя Live/Dead (Backlight™), накрывают покровным стеклом и выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Из каждой пробы мяса или мясного продукта препараты готовят на 3-х параллельных предметных стеклах.

Полученные окрашенные препараты из супернатанта (фиг. 1) и осадка (фиг. 2, 3) микроскопируют в люминесцентном микроскопе с увеличением не менее ×320 с синим светофильтром и визуально оценивают наличие микробиоты. В каждом препарате просматривают не менее 25 полей зрения. Затем проводят их фотосъемку без вспышки в режиме, повышающим контраст фотосъемки, неспециализированным фотоаппаратом общего назначения. Снимки переносят в компьютер. Подсчет живых (зеленых) клеток и мертвых (оранжево-красных) клеток проводят на фото в компьютере. Среднее количество клеток по всем видам образцов подсчитывается как среднее арифметическое по всем полям зрения (количество клеток в полях зрения, деленное на число полей зрения).

С целью повышения достоверности и сохранения результатов как отчетной, технологической и юридической документации выполняется архивирование снимков в компьютере.

Продукт считают свежим, если в окрашенных препаратах обнаружены единичные живые (зеленые) клетки (до 10 клеток) или в поле зрения препарата видны не более 30 оранжево-красных (мертвых) клеток.

Продукт считают сомнительного качества, если в препаратах обнаруживают в поле зрения до 30 зеленых (живых) клеток и/или более 30 оранжево-красных (мертвых) клеток.

Продукт считают несвежим и опасно контаминированным при наличии в поле зрения массивного количества (свыше 30) зеленых (живых) клеток и несколько десятков оранжево-красных (мертвых) клеток.

В случае сомнительного результата опыты повторяют 2 раза по аналогичной схеме и определяют КМАФАнМ согласно ГОСТ 10444.15-94 [1]. При количестве микроорганизмов, незначительно превышающем указанную численность в люминесцентных образцах продуктов, вопрос о необходимости посева на питательные среды решается экспертом.

В случае несоответствия численности микроорганизмов указанным количественным показателям в исследуемых пробах определяют КМАФАнМ по стандартной методике согласно действующим НТД.

Пример 2. Отбор и подготовку проб измельченного мяса (фарша) животного происхождения проводят согласно ГОСТ Р 51447-99[2]. Пробы хранят до полного завершения испытаний в холодильнике при температуре от 0°С до +5°С.

Анализ мясного фарша проводят по ГОСТ Р 54354-2011 [3]. Для определения контаминации мясного фарша берут из различной глубины (1-5 см) стерильным шпателем 20-30 г навески. Затем 1 г фарша из объединенной пробы помещают в стерильную центрифужную пробирку с 9 мл физиологического раствора.

Смесь перемешивают на вортексе (мешалке) в течение 30-60 сек, затем пробирку переносят в центрифугу с режимом работы 10 тыс. об/мин в течение 5-8 мин. При меньшем количестве оборотов (например, 5 тыс. об/мин) центрифугирование выполняют в течение 10-15 мин. Дальнейшему анализу подвергают как супернатант (надосадочная жидкость), так и осадок.

Для обнаружения микробных клеток в супернатанте готовят препарат методом «раздавленной капли»: на 3 чистых предметных стекла наносят 2 капли (по 7 мкл) супернатанта, добавляют 1,5 мкл рабочего раствора флуоресцентного красителя Live/Dead (Backlight™) (разведение в дистиллированной воде 1:10), накрывают покровным стеклом и выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Такое же соотношение реагентов сохраняется при изучении препаратов из осадка центрифугированных суспензий. Для изучения осадка готовят по 2 мазка на 3-х предметных стеклах. Возможно растирание материала по стеклу петлей или покровным стеклом тонким слоем.

Полученные окрашенные препараты образцов суспензии (фиг. 1), а также осадка (фиг. 2, 3) (не менее 6 образцов каждой пробы) микроскопируют в люминесцентном микроскопе с увеличением не менее ×320 с синим светофильтром и визуально оценивают наличие микробиоты. На одном предметном стекле анализируют не менее 25 полей зрения. Затем проводят их фотосъемку без вспышки в режиме, повышающим контраст фотосъемки, неспециализированным фотоаппаратом общего назначения. Снимки переносят в компьютер. Подсчет живых (зеленых) клеток и мертвых (оранжево-красных) клеток проводят на фото в компьютере. Среднее количество клеток по всем видам образцов подсчитывается как среднее арифметическое по всем полям зрения (количество клеток в полях зрения, деленное на число полей зрения).

С целью повышения достоверности и сохранения результатов как отчетной, технологической и юридической документации выполняется архивирование снимков в компьютере.

Продукт считают свежим, если в препаратах обнаружены единичные живые (зеленые) клетки (до 10 клеток) или в поле зрения препарата видны не более 30 оранжево-красных (мертвых) клеток.

Продукт считают сомнительного качества, если в препаратах из осадка и супернатанта обнаруживают в поле зрения до 30 зеленых (живых) клеток и/или более 30 оранжево-красных (мертвых) клеток.

Продукт считают несвежим и опасно контаминированным при наличии в поле зрения массивного количества (свыше 30) зеленых (живых) клеток и несколько десятков оранжево-красных (мертвых) клеток.

В случае сомнительного результата проводят еще 2 тестирования продукта по аналогичной схеме.

При количестве микроорганизмов, незначительно превышающем указанную численность в люминесцентных образцах продуктов вопрос о необходимости посева на питательные среды, решается экспертом. В случае несоответствия численности микроорганизмов указанным количественным показателям в исследуемых пробах определяют КМАФАнМ по стандартной методике согласно действующим НТД.

Таким образом, использование способа экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов позволяет быстро, в течение 3-5 часов получить ответ о возможности /невозможности использования мяса, мясного продукта, уменьшить расход лабораторной посуды, питательных сред, сократить количество человеко-часов на проведение микробиологической экспертизы, т.е. получить экономическую выгоду, а также сохранить полученные изображения анализированных образцов в электронном виде в компьютере как отчетную, технологическую и юридическую документацию.

Следовательно, использование изобретения по сравнению с прототипом позволяет быстро провести требуемую микробиологическую экспертизу в пределах 5 часов и сэкономить финансовые средства и оборудование. Способ может быть использован при микробиологическом анализе различных образцов мяса и мясных продуктов в государственных лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизы (ГЛВСЭ) на продовольственных рынках, в бактериологических лабораториях предприятий пищевой промышленности, сельского хозяйства, в медицине, экологии и в научно-исследовательских лабораториях.

Литература

1. ГОСТ 10444.15-94 «Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов».

2. ГОСТ Р 51447-99 «Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб».

3. ГОСТ Р 54354-2011 «Мясо и мясные продукты. Общие требования и методы микробиологического анализа».

4. ГОСТ 31931-2012 «Мясо птицы. Методы гистологического и микроскопического анализа».

5. ГОСТ Р 50396.0-2013 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям».

6. Лабинская А.С., Блинкова Л.П., Ещина А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. 4-е изд., стереотип. - СПб.: Лань, 2020. - 592 с.

7. Соколова Н.А., Абдуллаева A.M. Практикум по общей микробиологии. 3-е изд., доп. и перераб. - СПб.: Квадро, 2019. - 174 с.

Изобретение относится к пищевой промышленности и касается способа экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах, включающего отбор проб из них, приготовление навески и нанесение на предметное стекло с последующим окрашиванием и микроскопированием, где навески проб гомогенизируют растиранием в стерильной фарфоровой ступке или стерильном стакане гомогенизатора, вносят 1 г гомогенизированного продукта в стерильную центрифужную пробирку с 0,9% физиологического раствора, перемешивают мешалкой, а затем центрифугируют, и наносят образец продукта на 3 предметных стекла по 2 образца, к которым добавляют разведенный дистиллированной водой флуоресцентный краситель Live/Dead Backlight, окрашенные образцы накрывают покровным стеклом и выдерживают в темноте, с последующим микроскопированием их в люминесцентном микроскопе с синим светофильтром при увеличении не менее ×320, просматривают не менее 25 полей зрения, делают их фотосъемку без вспышки в режиме повышенной контрастности, переносят изображение в компьютер, подсчитывают в полях зрения всех видов образцов только количество живых/зеленых и мертвых/оранжево-красных микроорганизмов, делят на количество полей зрения с получением средней арифметической величины. Изобретение обеспечивает экономию времени проведения экспертизы с 48-72 ч до 3-5 ч, лабораторной посуды, питательных сред. 3 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ экспресс-детекции жизнеспособных микроорганизмов в мясе и мясных продуктах, включающий отбор проб из них, приготовление навески и нанесение на предметное стекло с последующим окрашиванием и микроскопированием, отличающийся тем, что навески проб гомогенизируют растиранием в стерильной фарфоровой ступке или стерильном стакане гомогенизатора при скорости 15-20 тыс. об/мин в течение 3-5 мин, вносят 1 г гомогенизированного продукта в стерильную центрифужную пробирку с 0,9% физиологического раствора, перемешивают мешалкой, а затем центрифугируют при 10 тыс. об/мин в течение 5-8 мин, и наносят образец продукта в виде мазков-отпечатков, супернатантов суспензий образцов и мазков из осадка суспензий на 3 предметных стекла по 2 образца, к которым добавляют 1,5 мкл разведенного дистиллированной водой 1:10 флуоресцентного красителя Live/Dead Backlight, окрашенные образцы накрывают покровным стеклом и выдерживают в темноте в течение 10 мин, с последующим микроскопированием их в люминесцентном микроскопе с синим светофильтром при увеличении не менее ×320, просматривают не менее 25 полей зрения, делают их фотосъемку без вспышки в режиме повышенной контрастности, переносят изображение в компьютер, подсчитывают в полях зрения всех видов образцов только количество живых/зеленых и мертвых/оранжево-красных микроорганизмов, делят на количество полей зрения с получением средней арифметической величины.