СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЦИТОРЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ САПНЫХ МИКРОБОВ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/06 

Предлагаемое изобретение относится к методам цитологического анализа микроорганизмов, в частности к методам прижизненного микроскопического исследования, и может быть использовано для выявления морфологических особенностей, присущих живым бактериям различных штаммов возбудителя сапа, их изменений в результате физических и химических воздействий и для экспрессного определения относительного содержания живых и мертвых клеток в полуфабрикатах вакцины против сапа.

Известны способы подготовки препаратов для прижизненного микроскопического исследования, состоящие в предварительном разведении анализируемого материала физиологическим раствором, дистиллированной водой с приготовлением на предметных стеклах препарата типа "раздавленная капля" для фазово-контрастной микроскопии, либо в окраске мазков специальными витальными красителями для обычных (амплитудных) микроскопов или в окраске микробов флуорохромами для люминесцентной микроскопии (Луста К.А., Фихте Б.А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов). - Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1990).

Общим с заявляемым способом является этап приготовления из исследуемого материала предварительного разведения.

К недостаткам способа приготовления препаратов типа "раздавленная капля" следует отнести отсутствие четких морфологических различий между живыми и мертвыми микробами в фазовоконтрастном микроскопе, а также подвижность клеток многих бактериальных видов в поле зрения, что препятствует микрофотосъемке, проведению измерений и подсчету.

К недостаткам способов приготовления мазков с использованием витальных красителей или флуорохромов следует отнести зависимость результатов окраски не только от жизнеспособности микробов, но и от их функционального состояния. Источником ошибок может быть также наличие в препаратах переходных форм микробов, которые окрашены и как живые, и как мертвые клетки. Отнесение таких микробов к живым или мертвым связано с большими трудностями и требует от оператора высокой профессиональной подготовки.

В качестве прототипа выбран способ подготовки препаратов бактерий для витального иммерсионного циторефрактометрического анализа (Фихман Б.А. Микробиологическая рефрактометрия - М.: Медицина, 1967 /1/).

Способ включает следующие этапы:
разведение анализируемой суспензии микробов физиологическим раствором;
нанесение на предметное стекло тонкого слоя специального желатинового геля, который по показателю светопреломления должен соответствовать живым клеткам исследуемого бактериального вида (подбор геля с необходимыми светопреломляющими свойствами производится заранее);
нанесение на покровное стекло капли приготовленной взвеси;
прикладывание покровного стекла с каплей взвеси на поверхность желатинового геля;
исследование приготовленного препарата при помощи иммерсионного фазовоаноптрального микроскопа.

В циторефрактометрических препаратах под аноптральным микроскопом живые клетки выглядят оптически пустыми. Они представлены лишь тонкими, светлыми оптическими эквивалентами оболочек. Их цитоплазма по цвету такая же, как фон поля зрения, либо слегка темнее его. Мертвые особи наблюдаются в виде полностью светящихся тел.

Метод был с успехом применен для исследования чумных и дизентерийных бактерий, стафилококка и кишечной палочки.

Общим с заявляемым способом являются следующие этапы:
разведение исследуемой суспензии;
нанесение на предметное стекло слоя желатинового геля;
нанесение на покровное стекло капли приготовленной взвеси;
прикладывание покровного стекла с каплей взвеси на поверхность геля;
исследование препарата в фазовоаноптральном микроскопе.

К недостаткам рассматриваемого способа следует отнести ограниченную область применения. Метод неприемлем для некоторых микроорганизмов. В частности, применительно к грибам и дрожжам, что связано с наличием у них большого количества вакуолей и включений, имеющих такие же рефрактометрические свойства, как и мертвые клетки.

Для бактерий некоторых видов метод неприемлем вследствие недостаточной четкости микроскопической картины и (либо) довольно быстрой гибелью клеток в связи с тем, что в препарате не обеспечиваются условия, необходимые для поддержания у них процессов жизнедеятельности.

Задачей изобретения является разработка способа приготовления циторефрактометрических препаратов сапных микробов, обеспечивающего сохранение их жизнедеятельности и наличие четкой микроскопической картины, что в комплексе необходимо для проведения достоверного анализа и микрофотосъемки.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе приготовления циторефрактометрических препаратов сапных микробов, включающем разведение суспензии, нанесение на предметное стекло желатинового геля, нанесение на покровное стекло капли взвеси, прикладывание покровного стекла на поверхность геля, предусмотрены следующие отличия:
исследуемую суспензию разводят не физиологическим раствором, а фосфатным буфером с добавлением к нему глюкозы и глицерина;
желатиновый гель используют с добавлением глицерина, но не в качестве пластификатора, а в значительно больших концентрациях, обеспечивающих поддержание метаболизма клеток.

Указанные отличия обусловлены следующими причинами:
желатина в процессе приготовления геля подвергается очистке и просветлению. По прототипу к ней в качестве пластификатора добавляют 0,1...0,3% глицерина. В циторефрактометрическом препарате после впитывания гелем физиологического раствора клетки оказываются на поверхности "голодной" среды, что может оказывать на некоторые микроорганизмы негативное влияние. Отсюда следует, что для сохранения жизнеспособности микробов в циторефрактометрическом препарате необходимо создать условия, направленные на поддержание метаболизма клеток и (или) на их консервацию;
сохраняемость микробов зависит от многих факторов, в том числе и от наличия в окружающей среде веществ, способных поддерживать процессы жизнедеятельности. Применительно к сапным микробам к таковым веществам относятся фосфаты, глицерин и глюкоза. Фосфаты применяют для установления необходимого уровня pH среды. Глюкоза и глицерин активно метаболизируются клетками Р. mallei;
необходимость обеспечения высокого контраста изображения клеток в препарате требует применения прозрачных растворов и веществ, добавление которых к желатиновому гелю не приводило бы к нарушениям его способности к гелеобразованию и (либо) к снижению прозрачности после многократного расплавления. Именно по этим причинам принято решение добавить к гелю глицерин в качестве энергетического субстрата и осмопротектора, а для разведения исследуемых материалов использовать фосфатный буфер с добавлением глицерина и глюкозы.

Способ включает следующие этапы:
разведение исследуемого материала фосфатным буфером с добавками;
нанесение на предметное стекло тонкого слоя желатинового геля с глицерином;
нанесение на покровное стекло капли приготовленной суспензии;
прикладывание покровного стекла с каплей взвеси клеток на поверхность застывшего желатинового геля;
исследование приготовленного препарата при помощи иммерсионного фазовоаноптрального микроскопа.

Способ выполняется следующим образом.

Заранее готовят:
0,15М фосфатный буфер на основе одно- и двузамещенных фосфатов калия pH 6,9...7,0 и 20%-ный раствор глюкозы. Для приготовления среды суспендирования клеток раствор глюкозы разводят в 20 раз буфером и затем к нему добавляют 0,1% (по объему) глицерина;
по методике, описанной в /1/, готовят желатиновый гель с показателем преломления 1,385 (в пересчете на сухой вес - 27%-ный желатиновый гель). В гель перед последней стерилизацией добавляют 3% глицерина по объему.

Фосфатным буфером с добавками глюкозы и глицерина разводят исследуемый материал до концентрации, соответствующей стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича на 10 ЕД мутности. Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой. Содержимое перемешивают встряхиванием. Желатиновый гель расплавляют на водяной бане и наносят в количестве 0,2...0,3 см³ по всей поверхности предметного стекла при помощи пипетки с резиновой грушей. Стекло для застывания геля устанавливают под углом 60^o к плоскости стола.

Подготовленное разведение материала при помощи пастеровской пипетки наносят в количестве около 0,005 см³ на центр покровного стекла. Его с каплей прикладывают глазным пинцетом к застывшему гелю на центральную часть предметного стекла.

По описанию, прилагаемому к фазовотемнопольному устройству МФА-2, настраивают фазовоаноптральную систему (микроскоп МБИ-3, либо МББ-1А, объектив ФА 90х, окуляры 7х).

Наносят на конденсор микроскопа каплю дистиллированной воды, а на покровное стекло препарата - иммерсионного масла. Препарат помещают на предметный столик микроскопа. Наводят микроскоп на резкость изображения. Живые сапные микробы имеют вид тонких узких палочек и овоидов, представленных в препарате светлым оптическим эквивалентом оболочки. Цитоплазма их по цвету такая же как поле зрения, либо темнее его. Мертвые микробы выглядят светлее фона поля зрения.

В каждом поле зрения отдельно подсчитывают живые и мертвые клетки. Всего требуется учесть не менее 500 клеток. Из результатов подсчета рассчитывают проценты живых клеток в исследованной пробе по формуле:
процент,
где ПЖ - процент живых клеток,
Ж - количество учтенных при подсчете живых клеток,
М - количество мертвых клеток.

Препараты для определения доли живых клеток и микрофотосъемки пригодны в течение 1,5 часов с момента приготовления. Затраты времени на анализ 1 препарата не превышают 30 минут, а на микрофотосъемку - 5 минут.

Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в табл. 1.

Предлагаемый способ подготовки циторефрактометрических препаратов имеет следующие преимущества:
позволяет определять относительное содержание живых микробов на основных этапах приготовления сапной вакцины;
позволяет получать информацию о морфологических особенностях живых клеток различных штаммов возбудителя сапа и производить прижизненную микрофотосъемку;
позволяет в витальных условиях изучать механизм действия на сапные микробы различных физических факторов, дезинфектантов и антибиотиков.

Возможность осуществления заявляемого способа показана следующим примером.

Пример 1.

Фосфатным буфером с добавками глицерина (0,1%) и глюкозы (1,0%) разводят культуру сапных микробов до концентрации, соответствующей стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича на 10 ЕД мутности. Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой, содержимое перемешивают встряхиванием. При помощи пипетки на 1,0 см³ с грушей наносят штриховыми движениями 0,2...0,3 см³ расплавленного желатинового геля с глицерином (3%) по поверхности предметного стекла. Стекло для застывания геля устанавливают под углом 60^o к плоскости стола.

Застывание геля при 18. ..20^oC продолжается около трех минут. Глазной пинцет при прикосновении к такому гелю не прилипает, а оставляет отпечаток.

После встряхивания пробирки около 0,005 cм³ культуры подготовленного разведения наносят при помощи пастеровской пипетки на центр покровного стекла. Его прикладывают глазным пинцетом к желатиновому гелю, застывшему на предметном стекле. Легким придавливанием пинцета обеспечивают распределение капли между покровным стеклом и гелем. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла. На фронтальную линзу конденсора наносят каплю дистиллированной воды. Препарат анализируют при помощи фазовоаноптрального микроскопа (объектив ФА 90х, окуляры 7х). Подсчитывают раздельно живые и мертвые клетки.

Живые клетки Р. mallei в циторефрактометрических препаратах выглядят оптически пустыми и представлены светлыми оптически эквивалентами оболочки. Их цитоплазма по цвету такая же, как поле зрения либо темнее его. Мертвые микробы выглядят в виде блестящих тел.

Из результатов подсчета рассчитывают проценты живых клеток в исследованной пробе по указанной выше формуле.

Микроскопическая картина сапных микробов в циторефрактометрических препаратах, приготовленных из одной и той же культуры штамма Ц-5 по прототипу представлена на фиг. 1, а на фиг. 2 - по предлагаемому способу.

Из сопоставления приведенных микрофотографий видно, что в циторефрактометрических препаратах, приготовленных по предлагаемому способу, обнаруживается значительно больше живых клеток, чем при использовании прототипа.

В табл. 2 приведены результаты параллельного определения процента живых клеток с использованием прототипа и предлагаемого способа в культурах штаммов Ц-5 и "Семипалатинский". Для проверки сходимости сопоставляемых способов пробы высевали на чашки Петри с плотной питательной средой. Абсолютную концентрацию клеток в культурах устанавливали подсчетом в гемоцитометрических камерах. Из отношения результатов высева к данным подсчета в камерах рассчитывали процент живых клеток в пробе по культуральному методу.

Из приведенных в табл. 2 данных следует, что использование разработанного способа приготовления препаратов обеспечивает получение результатов, практически не отличающихся от данных культурального метода. Применение прототипа приводит к существенному занижению доли живых клеток. Это свидетельствует о том, что разработанный способ приготовления препаратов повышает объективность циторефрактометрического анализа и обеспечивает удовлетворительную сходимость его результатов с данными высева на чашки Петри с питательной средой.

Изобретение относится к методам циторефрактометрического анализа микроорганизмов и может быть использовано для экстренного определения относительного содержания живых клеток в различных материалах на этапах приготовления вакцин против сапа и для витального морфологического исследования различных штаммов возбудителя сапа. Сущность метода заключается в том, что взвеси сапных микробов разводят 0,15 М фосфатным буфером рН 6,9 - 7,0 с добавками глюкозы (1%) и глицерина (0,1%), а для приготовления препарата применяют желатиновый гель, содержащий 3% глицерина. 2 ил., 2 табл.

Способ приготовления препаратов для циторефрактометрического исследования сапных микробов, включающий предварительное разведение исследуемого материала, отличающийся тем, что микробную суспензию разводят 0,15 М фосфатным буфером на основе одно- и двухзамещенных фосфатов калия pH 6,9 - 7,0 с добавками 1,0% глюкозы и 0,1% глицерина, а для приготовления препарата используют желатиновый гель, содержащий 3% глицерина как питательного субстрата.