Способ определения количества микроорганизмов Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к микробиологии, иммунологии, санитарии и гигиене.

Целью изобретения является повышение точности и разрешающей способности метода за счет определения любой концентрации и различных микроорганизмов.

Для осуществления заявленного способа необходима видоизмененная камера для счета форменных элементов кроои (камера Горяева). в которой глубину счетной камеры уменьшили со 100 мкм до 4 мкм. Такой размер камеры обусловлен размерами микроорганизмов. Микроорганизмы практически всех видов (кокки и палочки) размещаются в счетной камере сданными размерами, причем одновременно видны в фокусе все микроорганизмы, находящиеся в камере (чертеж).

Уменьшение глубины камеры происходит за счет уменьшения плотностей, на которых притирают покровное стекло, на 96 мкм. Измененная таким образом камера для счета форменных элементов крови дает возможность точно, быстро и дешево определять любое количество микроорганизмов, причем люОых оидоо (кокки и палочки)

Осуществляется способ следующим образом.

Перед исследованием камеру для счета микроорганизмов и покровное стекло тщательно моют, обезжиривают и высушивают. Затем покровное стекло (толщине, мкм) накладывают на плоскости и притирают до появлении колец Ньютона. Подготовленную для работы камеру заполняют рабочей смесью микроорганизмов, удаляя при этом ее лишнее количество. Рабочую смесь микроорганизмов готовят следующим образом К 4,0 мл 10% рпствора глюкозы добавляют 0,02 мл суспензии микроорганизмов и тщательно перемешивают. Использование насыщенного раствора высокомолекулярной глюкозы обусловлено тем, что она способствует фиксации микроорганизмов растворе и препятствует их беспорядочному движению, что неизбежно происходит р низкомолекулярном растворе и зничительно

Ј

СО

i-N

(Л

затрудняет подсчет. Подсчет микроорганизмов проводят о фазово-контрэстном микроскопе под -иммерсионной системой при увеличении ОВхЭО, (Жх7-10 в 5 больших квадратах счетной сетки по диагонали.Ь

Учитывая, что объем используемой камеры после уменьшения равен 1(100 000 мл / 1/20 х 1/20 х 1/250) расчет количества микроорганизмов проводят по следующей формуле 0

Ах 10 000 х Б

X

В

где X - количество микроорганизмов в 1 мкл;

А - количество микроорганизмов в 5 больших квадратах;

100 000 - постоянное число для перевода объема камеры к 1 микролитру;

Б - степень разведения;

В - количество малых квадратов.

Например. А 10, Б 200, В 80, тогда

Х- 10X10000PJL20Q.5X106 микро- oU

организмов в 1 мкл.

Процент ошибки при подсчете микроор- ганизмов в данной камере такой же,как и при подсчете клеток крови в камере Горяева, и равен примерно 3-5%.

После определения количества микробов в исследуемой суспензии в последнюю после соответствующих расчетов добавляют необходимое количество исходной суспензии микроорганизмов (если микроорганизмов меньше необходимой концентрации) или физиологический рас- твор (если микроорганизмов больше необходимой концентрации). В полученной суспензии определяют количество микроорганизмов и если оно соответствует рабочей концентрации, то используют в соответствующих исследованиях. Если же количество микроорганизмов больше или меньше необходимой концентрации, то повторяют выше описанную процедуру довода и контроля количества микроорганизмов еще раз до необходимой концентрации. Обычно если расчет и разведение физиологическим раствором или добавление исход- ной суспензии микроорганизмов проводится точно и аккуратно, то необходи- мое количество микроорганизмов в рабочей суспензии получают с первого раза. Полученную таким образом рабочую суспензию микроорганизмов с заданной концентрацией используют в необходимых исследова- ниях,

Пример. Определение и доведение количества микроорганизмов до необходимой концентрации и в оптимальном варианте Однодневную культуру золотистого

стафилококка штамм Ленин смывают с питательной среды 10,0 мл физиологического раствора (микроорганизмы убивают путем нагревания в течение 2 часов при +70°С, а затем их разбавляют физиологическим раствором до приблизительно необходимой концентрации (1 х 106в 1 мкл под контролем глаза по мутности (оптической плотности) раствора. После этого суспензию разводят в 200 раз в 40% растворе глюкозы, путем добавления 0.02 мл разбавленной суспензии микроорганизмов к 4,0 мл 40 % раствора глюкозы и тщательно перемешивают. Полученной рабочей смесью микроорганизмов заполняют видоизмененную камеру для счета форменных элементов крови с высотой 4 микрона. При этом высокомолекулярный раствор глюкозы в концентрации 40% препятствует беспорядочному движению микробов. Далее считают количество микроорганизмов в 5 больших квадратах по диагонали счетной сетки камеры в фазово-контрастном микроскопе под иммерсионной системой при ОБх90,ОКх7-10. В 5 больших квадратах (или 80 малых) находилось 8 микроорганизмов. Следовательно, количество микроорганизмов равно

Y 8x100000x200 0 1Пе щ

X дтс 2 х 10 в 1,0 мкл.

То есть количество микроорганизмов в 2 раза больше необходимой концентрации. Для приведения концентрации микробов до необходимой величины суспензию микроорганизмов разводят физиологическим раствором в 2 раза и проводят дополнительный контрольный подсчет микроорганизмов как описано выше. Количество микроорганизмов в 5 больших квадратах равнялось 4. Следовательно, количество микроорганизмов равно

v 4х 100000x200 . 1П6 . п RO 1 х 10 в 1.0 мкл.

Полученная таким образом рабочая суспензия микроорганизмов с необходимой концентрацией (1 х Ю6 в 1,0 мкл) готова к употреблению в исследовательской работе.

П р и м е р 2. Уменьшение высоты счетной камеры до 3-1 мкм.

Уменьшение высоты счетной камеры до 3-1 мкм невозможно, ибо в таком случае будет весьма затруднено, а для некоторых микробов вообще невозможно, заполнение счетной камеры суспензией микроорганизмов, размеры которых в среднем варьируют от 1 до 2-3 мкм.

П р и м е р 3. Уменьшение высоты счетной камеры больше 4 микрон

Уменьшение высоты счетной камеры больше 4 микрон нецелесообразно, ибо

При ЭТОМ фОКуС МИКрОГСОМЛ ПЛСПОЛОженных в расположенных в разных плоскостях микроорганизмов будет различным, что значительно затрудняет подсчет микроорганизмов. Таким образом, чем выше глубина камеры, тем больше разница в фокусе микроскопа для микроорганизмов,расположенных в разных плоскостях, тем сложнее и менее точно происходит подсчет микроорганизмов.

Сравнение конечных результатов (т.е. подсчитанное количество микроорганизмов в единице объема рабочей суспензии), полученных при использовании способа-прототипа и заявленного способа показано в табл.1. В способе-прототипе количество микроорганизмов в рабочей суспензии определялось одним исследователем с помощью соответствующего стандарта мутности на 1,0 х 106в 1,0мкл. Определение проводилось трижды, а контролировалось с помощью заявленного способа. Следует отметить, что определение количества микроорганизмов с помощью способа-прототипа разными исследователями неизбежно приводит к еще большему процентному ошибки за счет субьективной оценки оптической плотности рабочей и эталонной суспензии микроорганизмов, проводимой под контролем глаза разных исследователей. Подтверждением этого являются результаты представленные в табл.2.

Сравнительный анализ способа-прототипа и заявленного способа показал, что

0

5

0

5

0

в заявленном способе процент ошибки при подсчете количества микроорганизмов значительно меньше, чем в способе-прототипе.и соответствует 3-5%. в способе прототипе процент ошибки составляет 30 -40%;

в запиленном способе возможно быстрое, точное и дешепое определение любой концентрации микроорганизмов в способе- прототипе возможно определение только стандартного (эталонного) количества мик- роорганизмоо;

в заяоленном способе возможно весьма длительное использование камеры для счета микроорганизмов; в способе-прототипе необходима замена стандарта мутности по истечению срока гарантии.

Использование предлагаемого способа позволяет достаточно точно (процент ошибки составляет 3-5%), быстро и дешево определять любое существующее количество всех видов исследуемых микроорганизмов (кокки и палочки).

Формула изобретения

Способ определения количества микроорганизмов путем их суспендирования в жидкой среде и подсчета в счетной камере. под микроскопом, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, микроорганизмы суспендируют в 40%-ном растворе глюкозы, а подсчет проводят в счегпой камере глубиной 4 мкм.

Использование: биология, медицина, микробиология, иммунология, санитария, гигиена. Сущность изобретения микроорга1 низмы суспендируют о 40%-ном растворе глюкозы, Подсчет микроорганизмов о исследуемой суспензии осуществляют в видоизмененной счетной камере глубиной 4 мкм в фазово-контпастном микроскопе. При использовании способа процент ошибки снижается с 30-40 до 3-5 %. 1 ил,, 2 табл

Количество микроорганизмов ( Staph. aureus штамм

Лепин), определенное с помощью способа-прототипа и

предлагаемого способа

Таблица 1

Контрольное определение количества микроорганизмов (Staph. aureus штамм Ле- пин), проведенное в одной и той же пробе с помощью способа-прототипа и предлагаемого способа разными исследователями

Поверхности для притерания покровного стекла

покровное стекло

Таблица 2

объектив микроокопа

иммерсионное масло

ми кроорг ани змы

.глубина счетной камеры 4 микрона