Способ определения активности фагоцитов Советский патент 1988 года по МПК G01N33/53 

00

оо ск со

113

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к иммунологии. ( Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа.

Пример 1, Исследование фагоцитарной активности лейкоцитов крови у больного К, с обострением хронического гранулематозного периодонтита.. i Приготовление тест-объекта. К навеске 20 мг ацетонвысушенных клеток микрококка добавляют 0,8 мл 0,01 N раствора NaOH и 0,2 мл раствора Люминола, полученного путем растворе ия 10 мг сухого люминола в 1 мл ;j имeтилcyльфoкcидa, Клетки с люмино- jjioM перемешивают на мешалке 20 мин 1 оставляют в темноте при комнатной фемпературе на 18-24 ч, затем осадок Клеток отмываю т от несвязавшегося люминола путем центрифугирования при 2000 об./мин (три раза по 5 мл 0, 9%- 4НОГО раствора NaCl). К отмытому Йсадку микрококков добавляют 2 мл О,9%-ного раствора NaCl и получают Меченные люминолом клетки микрококка а дозе 20 мг/мл . Данная суспензия 1 |икрококка сохраняет свою активность в течение 1-2 мес в условиях хранени 4°с.

Дпя постановки реакции определени 4|агоцитарной активности лейкоцитов . к|рови берут из пальца обследуемого )К|ровь в количестве 0,2-0,3 мл в к икропробирку с гепарином (20ед./мл) По 25 мкл крови разливают в три кюветы (объемом 3 мл), предназначенные рля измерения хемилюминесценции на лриборе люминометре (LKB-1250, Фин- л|яндия) . В кюветы добавляют по 100 мк tecT-объекта в разведении 1,2 мг/мп, закрьгеают колпачками и встряхивают в течение 20-30 с на приборе микровстряхивателе для микропробирок или путем постукивания по столу для равномерного распределения капли крови с тест-объек ом по дну кюветы. Затем пробирки инкубируют в термостате на и через 15, 30, 45 мин измеряют степень хемилюминесцендии на при- боре. При снятии показаний свечения, мВ, с дисплея прибора записывают наибольшую цифру из трех, возникающих каждые 1-2 с. Интенсивность фагоцитоза лейкоцитами тест-объекта выра- лают светосуммой трех изделий. Одновременно с исследованием кро ви больного определяют фагоцитарную актив

0 5 о

Q 0 5

5

12

ность у постоянного донора. Фагоцитарную активность лейкоцитов крови больного выражают в процентах к таковой у донора по формуле: (А:В)х100, где А и В - светосумма хемилюминесценции лейкоцитов с тест-объектом у больного и донора, соответственно.

В табл. 1 приведены результаты определения фагоцитарной активности у больного с обострением хронического гранулематозного периодонтита до и после лечения (на каждого больного и донора брали пв 3 кюветы).

Из табл. 1 видно, что у больного до лечения отмечалось снижение фагоцитарной активности лейкоцитов крови, а к концу лечения она восстанавливалась и приблизилась к таковой у здорового донора. Таким образом, предложенный способ, позволяет определить степень восстановления защитных сил организма в процессе лечения периодонтита.

П р и м е р 2. Исследование у донора фагоцитарной активности лейкоцитов крови при использовании различных ее объемов.

Этапы те же, что. и в примере 1, за исключением того, что кровь берут из вены, вносят в кювету в объеме 10, 25, 50 и 100 мкл и тест-объект в объеме 10 мкл в той же концентрации, что и в примере 1. Пробы встряхивают на протяжении 20 с. Результаты исследований приведены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что увеличение объема крови до 100 мкл в,пробе ведет к уменьшению интенсивности хемилюминесценции, тем самым снилсается чувствительность реакции: объемы крови 25 и 50 мкл дают более сильную кемилюми- несценцию. При использовании 10 мкл хемилюминесценция ниже, чем в остальных пробах. . Однако выявление :емилю- минесценции в 10 мкл крови само по себе свидетельствует о преимуществах метода, так как позволяет в необходимых случаях использовать . кровь и в таких микрообъемах (например, в педиатрии).

Предложенный способ проще известного, так как нет необходимости готовить синтетические микросферы и покрывать их белком. Он обладает большей чувствительностью в 10 раз, поэтому может быть использован в случаях, когда уменьшено количество фагоцитов за счет патологии или у определенных видов животных, а также в случае низкой чувствительности люми- нометра. Способ предполагает использование микрообъемов крови, поэтому может быть использован в педиатрии или у .мелких животных.

Формула изобретения

Способ определения активности фа- гоцитов путем смешивания фагоцитов с суспензией меченного люминолом

тест-объекта, инкубации при 37°С в течение 30-40 мин с последующим учетом результатов по измерению реакции хемилюминесценции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, в качестве тест-объекта нсполь зуют микроорганизмы Micrococcus lyso- dokticus,a инкубацию проводят в монослое фагоцитов при их соотношении с тест-объектом 1:10.

Таблица 1

Изобретение относится к медицине, точнее - к иммунологии. Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа. Для этого производят исследование фагоцитарной активности лейкоцитов крови у пациента. Смешивают фагоциты с суспензией меченного люминалом тест-объекта. В качестве тест-объекта используют микроорганизмь Micrococcus lysodok- ticus. Проводят инкубацию при 37 С в монослое фагоцитов при их соотношении с тест-объектом 1:10. Затем ставят реакцию хемилюминесценций (ХЛ) и через 15, 35, 45 мин измеряют степень ХЛ на приборе. 2 табл. с S (Л

Светосумма хемилюминесценции, мВ

Обследуемый1

до лечения после лечения

Б-ой К. Обострение хро- 7,8 7,4 7,5 11,5 14,3 12,3

нического гранулематозного периодонтита Среднее 7,5 Среднее 12,7

Здоровый донор 10,6 15,7 12,4 13,0 14,5 12,8

Среднее 12,9 Среднее 13,4

% к показателю фагоцитоза у донора58,1 94,7

Таблица 2

Светосумма хемилюминесценции мБ, в зависимости от объема

крови, мкл

10 1 ° I °°

7,1 12,1 14,9 10,0 to,50 ±0,81 ±0,60 to,80

. , -1

Составитель П. Бонарцев Редактор В. Данко Техред Л.Сердюкова Корректор Л. Патай

Заказ 1491/43 Тираж 847Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113033, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4