СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ IN VITRO СПЕЦИФИЧЕСКОЙ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЗМА К БАКТЕРИАЛЬНЫМ АЛЛЕРГЕНАМ Российский патент 2016 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам контроля состояния организма.

Известно, что бактериальная инфекция является причиной развития инфекционно-аллергических заболеваний, таких как гломерулонефрит, ревматизм, крупозная пневмония, некоторые формы бронхиальной астмы (БА) и др. [Патология: курс лекций / Под ред. М.А. Пальцева. - 2-e изд., стереотипное. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2007]. Среди инфекционно-аллергических заболеваний особое место занимает инфекционно-аллергическая БА, являющаяся наиболее распространенной формой БА. [Пыцкий В.И. Механизмы возникновения и развития бронхиальных астм и основные принципы их лечения. - М.: «Фармарус Принт Медиа», 2008. - 56 с. ]. В качестве причинных факторов, которые могут вызвать развитие этой формы БА, выступают инфекционные факторы (вирусы, бактерии, грибки). Адо А.Д, Адрианова Н.В., Федосеева В.Н., Довжик В.П. [Клиническая аллергология: Рук-во для практических врачей / Под. ред. акад. РАМН, проф. P.M. Хаитова - М.: МЕДпресс-информ, 2002. - 624 с. ] при изучении микробного пейзажа слизистых дыхательного тракта пациентов с инфекционно-аллергической формой бронхиальной астмы выявлено разнообразие микрофлоры, которая была представлена в основном 14 видами условно-патогенных и сапрофитных микроорганизмов. Чаще всего определялось 4-5 видов микроорганизмов у 57,4+5% больных, моноштаммная культура выделялась у 72+2,6%. Из полости носа чаще выделялся Staphylococcus aureus, из зева - Corinobakteria, Streptococcus viridau, Staphylococcus aureus, из бронхов - Neisseria perflava и Streptococcus viricbeus, Candida albicans. При внутрикожном тестировании с бактериальными аллергенами обнаружено положительных внутрикожных тестов на аллерген из Neisseria perflava у 95%, Staphylococcus aureus и alb. - у 83%, Klebsiella pneumonia- у 78%, Pneumococcus- у 7% больных. Условно-патогенная и слабовирулентная флора дыхательных путей у атопиков может вызвать сенсибилизацию и развитие инфекционно-аллергической формы БА. Основным методом лечения больных этой формы БА является специфическая иммунотерапия (СИТ) [Пыцкий В.И. Механизмы возникновения и развития бронхиальных астм и основные принципы их лечения. - М.: «Фармарус Принт Медиа», 2008. - 56 с. ], суть которой заключается в снижении степени сенсибилизации больных к тем аллергенам, которые являются причинами данных атопических заболеваний. Поскольку СИТ проводится у больных инфекционно-аллергической БА с доказанной сенсибилизацией к конкретным бактериям или грибкам, вегетирующим в дыхательных путях, целесообразно определять наличие сенсибилизации к причинным инфекционным аллергенам.

Известно, что при инфекционно-аллергической БА обнаруживается патология придаточных пазух носа (аллергический риносинусит, полипоз носа, признаки инфекции) [Пыцкий В.И., Адрианова Н.В.. Артомасова А.В. Аллергические заболевания. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Издательство «Триада-Х». - 1999. - 470 с. ]. В настоящее время широко обсуждается роль Staphylococcus aureus в этиологии и патогенезе полипозного риносинусита больных БА. Так, показано, что колонизация золотистого стафилококка в среднем носовом ходе у пациентов с полипозом носа выше (64%), чем у здоровых лиц (33%) и больных хроническим синуситом без полипов (27%) [Г.П. Бондарева, А.Б. Туровский, О.В. Семкина. Роль золотистого стафилококка при полипозном синусите / Российский Аллергологический Журнал. - 2013. - №6. - С. 5-8]. Также установлено, что уровень колонизации золотистого стафилококка прямо пропорционален содержанию специфических IgE-антител к его энтеротоксинам [Gevaert P., Holtappels G., Johansson S.G. et al. Organization of secondary lymphoid tissue and local IgE formation to Staphylococcus aureus enterotoxins in nazal polyptissue. Allergy. 2005, v. 60, p. 71-79]. Van Zele и соавт. [Van Zele Т., Gevaert P., Watelet J.B. Staphylococcus aureus colonization and IgE antibody formation to enterotoxins in increased in nazal poliposis. J. Allergy Clin. Immunol. 2004. - v. 114. - p. 981-983] в своей работе показали, что наличие у пациента с полипозным риносинуситом непереносимости аспирина и бронхиальной астмы повышает распространенность стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей до 87,5%, при этом IgE-антитела к стафилококковым энтеротоксинам обнаруживают в 80% случаев.

При обнаружении стафилококковой колонизации слизистой оболочки носовых путей у пациентов с подтвержденной сенсибилизацией к антигенам стафилококка показана системная антибактериальная терапия, что повышает эффективность противорецидивной консервативной терапии полипозного риносинусита и терапии БА [Г.П. Бондарева, А.Б. Туровский, О.В. Семкина. Роль золотистого стафилококка при полипозном синусите / Российский Аллергологический Журнал. - 2013. - №6. - С. 5-8]. Таким образом, выявление сенсибилизации к антигенам золотистого стафилококка открывает возможность применения эффективных методов лечения, которые позволяют предотвратить возникновение рецидивов заболевания и улучшить его прогноз.

Основным методом иммунодиагностики гиперчувствительности к бактериальным аллергенам служит метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий производить количественное определение аллергенспецифических IgE-антител в крови больного. Однако данная методика является дорогостоящей и требует специально обученных сотрудников. Кроме того, данный анализ направлен на выявление гиперчувствительности к определенному бактериальному аллергену, а не к их группе. В тех случаях, когда конкретный бактериальный возбудитель неизвестен, для диагностики гиперчувствительности необходимо исследовать целый спектр антигенов, что существенно повышает стоимость исследования. Отрицательный ответ в этом случае не обязательно означает отсутствие сенсибилизации к бактериальным аллергенам - может оказаться так, что исследование на антиген, к которому существует гиперчувствительность, просто не проводили.

В то же время существует универсальный метод исследования биологических жидкостей, в котором используется хемилюминесценция, сопровождающая реакции с участием радикалов. Хемилюминесцентный метод позволяет изучать патологические процессы, в патогенезе которых важную роль играет оксидативный стресс (Владимиров Ю.А., Проскурина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. // Успехи биологической химии, - т. 49, - 2009, - с. 341-388). В частности, известно, что бактериальные антигены могут инициировать развитие оксидативного стресса и, следовательно, оказывать стимулирующее действие на люминол-зависимую хемилюминесценцию гранулоцитов [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминесценция клеток животных // Итоги науки и техники. Серия биофизика. 1989 - Том 24. - 176 с. ]. Поэтому мы решили использовать хемилюминесцентный метод для диагностики гиперчувствительности к бактериальным антигенам.

В патенте (RU 2445626 C1, КрасГМУ, 20.03.2012) оценивают параметры кинетики хемилюминесценции, индуцированной взвесью клинического штамма метицилленрезистентного Staphylococcus aureus, по которым оценивают функциональную способность фагоцитирующих клеток. Взвесь клинического штамма Staphylococcus aureus используют в качестве индуктора «дыхательного взрыва» лейкоцитов, то есть индуктора фагоцитоза. Однако в этом случае возможно образование иммунных комплексов и выброс медиаторов из базофилов, что изменит параметры ХЛ и затруднит интерпретацию результатов.

В патенте (RU 2289138 С2, НИИ микробиологии…, 10.12.2006) описан способ аллергодиагностики, в котором выделяют нейтрофильные лейкоциты, проводят формирование иммунных комплексов, измеряют фоновую люминесценцию среды инкубации, добавляют нейтрофилы, измеряют уровень спонтанной хемилюминесценции, затем вносят иммунный комплекс и определяют значение стимулированной хемилюминисценции, по которым диагностируют аллергическую реакцию. К недостаткам следует отнести как большой объем крови (10 мл), так и сложность и длительность анализа.

В патенте (RU 2320991 С2, Матела и др., 27.03.2008) описан способ подбора иммунокоррегирующего препарата, при котором производят забор периферической крови, получают лейкоцитарную суспензию, суспензию клеток инкубируют с иммунокоррегирующими препаратами в течение 60 мин при 37°С. Затем производят запись кривых люминол-зависимой хемилюминесцентной реакции (ХЛ) и рассчитывают индекс стимуляции препарата (ИС). К недостаткам следует отнести большой расход крови и реактивов (для выделения лейкоцитов), длительность исследования.

Наиболее близким по назначению является способ определения индивидуальной чувствительности к антибактериальным препаратам, которые могут выступать в роли аллергенов для лиц, сенсибилизированных к данным антигенам, в части выбора антибиотика при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний (RU 2495422 С2, Савченко и др., 10.10.2013 - прототип). Проводят измерение спонтанной и модифицированной антибиотиками люцигенин-зависимой хемилюминесценции цельной крови пациента. Затем рассчитывают коэффициент, представляющий собой отношение разности площадей под кривой хемилюминесценции с антибиотиком (S_АНТ) и под кривой спонтанной хемилюминесценции (S_СП), отнесенный к S_СП, выраженный в процентах. По этим величинам осуществляют оптимальный подбор антибиотиков.

Однако способ-прототип не предусматривает определение у пациента специфической сенсибилизации к бактериальным антигенам, а также не устанавливает факта наличия бактериальных инфекций, в том числе скрытых.

Задачей настоящего изобретения является расширение функциональных возможностей способа-прототипа, а именно определение не только сенсибилизации к тем или иным бактериальным антигенам, но и выявления бактериального воспаления в организме пациента, в том числе скрытой бактериальной инфекции, что и является техническим результатом изобретения.

Патентуемый способ дифференциальной диагностики in vitro специфической сенсибилизации пациента к бактериальным аллергенам состоит в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата, содержащего бактериальные антигены, и сравнении показателей люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) с одноименными показателями, полученными для здорового организма.

Отличие состоит в следующем. В отобранную кровь пациента вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие (0,95-1,05)×10⁶ лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови.

Тестируемый препарат бактериальных антигенов или смесь тестируемого препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил и контрольный препарат в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови и их инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут. Затем в инкубированные пробы вводят активатор люминол в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанного активатора, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанного активатора, причем измерения ХЛ проводят при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут с получением временных зависимостей уровня ХЛ.

Вычисляют индексы ИП по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов соответственно, по которым диагностируют специфическую сенсибилизацию к бактериальным аллергенам.

Тестируемый препарат бактериальных антигенов Staphylococcus aureus разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×10⁴ микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,25 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Staphylococcus aureus.

Тестируемый препарат бактериальных антигенов Klebsiella pneumonia разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×10⁴ микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,78 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора, диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Klebsiella pneumonia.

При тестировании смеси препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил сначала в пробы крови вводят упомянутый препарат, растворенный в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,1×10^-4 М, после чего пробы инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°С в течение 10 минут, затем одну часть полученных проб используют в качестве контрольных, а другую часть - в качестве тестируемых, для чего в пробы вводят тестируемый препарат бактериальных антигенов и осуществляют повторное инкубирование при том же режиме, а

специфическую сенсибилизацию организма к упомянутым бактериальным антигенам диагностируют при значении отношения (ИП_Т:ИП) меньшем или равном 0,8, где ИП_Т - индекс, вычисленный для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом; ИП - индекс, вычисленный для пробы с бактериальными антигенами.

Способ может характеризоваться тем, что хемилюминометр представляет собой биохемилюминесцентный автоматический анализатор БЛМ 3606М-01 с компьютерной программой BLM - Obrab, производства СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия.

Достижение технического результата основано на проведенных заявителем детальных исследованиях. Определялось воздействие бактериальных антигенов, в частности комплексных антигенов Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae на секрецию АФК полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЛ) у здоровых доноров и больных с астматической триадой (бронхиальная астма, полипозный риносинусит, непереносимость НПВП). Также было установлено, что предварительная инкубация крови больных с гнойно-воспалительными процессами (абсцесс, флегмона, синдром диабетической стопы, нагноение ран и др.), вызванными микроорганизмами Staphylococcus aureus и/или Streptococcus pyogenes (при микробиологическом исследовании гнойного экссудата выявлялся Staphylococcus aureus и/или Streptococcus pyogenes), сопровождается увеличением показателей ИП относительно значений ИП у здоровых доноров [Е.А. Усанова, Ю.П. Сюсюкин, Е.Э. Арутюнова, Ю.В. Балякин. Праймирующее действие Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes на полиморфно-ядерные лейкоциты крови при острых гнойно-воспалительных заболеваниях. // Сб. тезисных докладов научно-практической конференции, посвященной 40-летию МБФ «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - 2003. - С. 94]. В связи с вышеотмеченным целесообразно проводить дифференциальную диагностику между гнойно-воспалительными процессами, вызванными микроорганизмами, и сенсибилизацией организма к бактериальным антигенам этих же микроорганизмов.

Дифференциальная диагностика обосновывается следующими результатами: обследован 41 пациент с астматической триадой (AT) со смешанной (неинфекционно + инфекционно-зависимой) и инфекционно-зависимой формами бронхиальной астмы в фазе ремиссии. Противопоказания к включению пациентов в исследование: проявления острой или обострение хронической инфекции, прием системных глюкокортикостероидов за 2 недели до исследования. У 17 пациентов с AT в сыворотке крови определялись специфические IgE к различным стафилококковым энтеротоксинам (SEA, SEB, TSST). У 10 пациентов с AT в сыворотке крови определялись специфические IgE к антигенам Klebsiella pneumonia. У 14 пациентов с AT сенсибилизации к стафилокококковым энтеротоксинам и другим бактериальным антигенам выявлено не было. Контрольная группа практически здоровых людей состояла из 20 человек, не сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами и другими бактериальными антигенами и не болевших острыми воспалительными заболеваниями в течение трех недель до срока проведения испытания.

Подготовку крови и исследование осуществляют следующим образом.

Используется гепаринизированная венозная кровь (концентрация гепарина - 50 ЕД/мл). Непосредственно перед проведением исследования во взятых образцах цельной крови определяется количество и жизнеспособность лейкоцитов. Из образцов крови отбирались пробы, содержащие 1×10⁶ лейкоцитов (объем крови составлял около 95-100 мкл), и доводят их объем до 0,69 мл средой Хенкса.

Затем к полученным образцам добавляют 0,01 мл препарата антигенов Staphylococcus aureus в различных разведениях (от 5×10⁶ до 1000×10⁶ микробных клеток на 1 мл суспензии). В контрольные пробы вместо комплексного препарата антигенов добавляют физиологический раствор в том же объеме.

Препараты бактериальных антигенов, содержащие 10⁹ микробных клеток на 1 мл суспензии, продукты жизнедеятельности, фрагменты бактериальных стенок, ферменты и токсины данного микроорганизма, готовили по методу В.Н. Федосеевой и В.А. Камышовой (RU 2183970 С1 от 27.06.2002) из штаммов бактерий клинических изолятов путем приготовления бактериальных комплексов на целлофановом диске.

Затем каждую пробу инкубировали при постоянном перемешивании при 37°С в течение 45 мин. После инкубации проводят измерение интенсивности хемилюминесценции (ХЛ) проб на 36-кюветном биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606-01 (г. Красноярск), сигнал от которого поступает на персональный компьютер и анализируется с помощью программы BLM-Obrab. В качестве активатора свечения используют люминол (регистрируется суммарная секреция активных форм кислорода).

Далее, в кювету хемилюминометра вносят 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл активатора (2 мМ). Далее измеряют уровень спонтанной ХЛ. После регистрации спонтанной ХЛ добавляют 0,15 мл стимулятора свечения - сульфата бария (2 мг/мл) и регистрируют уровень стимулированной ХЛ. Измерение ХЛ крови проводят в режиме постоянного перемешивания при температуре 37°С.

Определяют следующие параметры хемилюминесценции: интенсивность спонтанной ХЛ, интенсивность максимальной ХЛ, время достижения максимальной вспышки ХЛ, площадь под кривой ХЛ, отражающую светосумму ХЛ.

Для оценки праймирующего влияния рассчитывают индекс (ИП) соотношения площадей под кривыми, равный отношению светосуммы ХЛ (Sба) опытной пробы (праймированной комплексным препаратом бактериальных антигенов) к светосумме ХЛ контрольной пробы (Sк). О повышенной чувствительности к бактериальному антигену судят по индексу ИП, определяемому по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов соответственно.

Зависимость ИП от концентрации комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus у доноров и больных с астматической триадой представлена в Табл. 1. У здоровых доноров комплексный антиген Staphylococcus aureus стимулирует секрецию АФК ПМЛ цельной крови. При этом эффект прайминга имеет характер обратно пропорциональный дозе бактериального антигена. Так, самая большая концентрация антигена 1000×10⁴ микр. кл./мл вызывала максимальное подавление секреции АФК ПМЛ. Стимуляция суммарной секреции АФК ПМЛ крови доноров выявлялась в диапазоне концентраций (5-50)×10⁴ микр. кл./мл. Максимальная стимуляция суммарной выработки АФК ПМЛ наблюдалась на самой минимальной концентрации 5×10⁴ микр. кл./мл., на указанной концентрации ИП=2,13.

Таким образом, у здоровых доноров комплексный бактериальный антиген Staphylococcus aureus оказывает праймирующее воздействие на секрецию АФК ПМЛ цельной крови. При этом эффект прайминга наблюдается в диапазоне концентраций (5-50)×10⁴ микр. кл./мл. Можно предположить, что прайминг ПМЛ запускается посредством контакта патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (РАМР) микроорганизмов с соответствующими им рецепторами лейкоцитов (Toll-like receptors), в результате чего реализуются процессы, ведущие к увеличению функционального потенциала ПМЛ, что в свою очередь влечет за собой усиление интенсивности ответа на последующее добавление этого же или другого стимула.

Исходя из полученных закономерностей влияния комплексного антигена Staphylococcus aureus на секрецию АФК ПМЛ доноров, исследовано, в какой мере они сохранятся у больных с астматической триадой. С этой целью исследовали влияние антигенов Staphylococcus aureus на секрецию АФК ПМЛ пациентов с астматической триадой. Поскольку предварительные исследования показали существенные различия в секреции АФК ПМЛ под воздействием антигенов Staphylococcus aureus при наличии или отсутствии у пациентов сенсибилизации к стафилококковым энтеротоксинам, все пациенты с AT были разделены на две подгруппы: сенсибилизированные и несенсибилизированные вышеупомянутыми антигенами.

Как видно из Табл. 1, у пациентов, не сенсибилизированных к стафилококковым энтеротоксинам, наблюдается снижение секреции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Незначительное праймирующее воздействие комплексного препарата антигенов Staphylococcus aureus на суммарную секрецию АФК ПМЛ цельной крови больных отмечалось только на самой малой концентрации АГ 5×10⁴ микр. кл./мл. ИП на указанной концентрации антигенов составлял 1,25. Затем по мере увеличения концентрации антигенов развивалось угнетение суммарной секреции АФК ПМЛ крови.

При исследовании стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой ХЛ крови больных, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, была выявлена выраженная стимуляция суммарной секреции АФК ПМЛ в широком диапазоне используемых концентраций комплексного антигена Staphylococcus aureus, значительно превышающая таковую здоровых доноров. Увеличение суммарной секреции АФК ПМЛ при предынкубации проб крови больных с комплексным антигеном Staphylococcus aureus отмечалось в диапазоне (5-250)×10⁴ микр. кл./мл и имело характер обратной дозовой зависимости. В частности, на концентрации 5×10⁴ микр. кл./мл ИП имел максимальное значение и составлял 3,34, в то время как у здоровых доноров ИП на данной концентрации был ниже (на 37%) и составлял 2,13.

Таким образом, у пациентов с астматической триадой, сенсибилизированных стафилококковыми энтеротоксинами, при предынкубации проб крови с комплексным антигеном Staphylococcus aureus наблюдалось значительное увеличение суммарной секреции АФК ПМЛ по сравнению со здоровыми донорами. Выраженная стимуляция люминол-зависимой ХЛ крови, по-видимому, происходит вследствие действия на нейтрофилы медиаторов (в частности, гистамина), высвобождающихся из базофилов при образовании на их поверхности иммунного комплекса аллерген - IgE, где в качестве аллергена выступают энтеротоксины стафилококка. По-видимому, биологически активные вещества, воздействуя на ПМЛ, способны изменять активность ферментов окислительного метаболизма ПМЛ и, следовательно, модифицировать исимую ХЛ крови. Наше предположение согласуется с ранними работами [Искусных А.Ю., Башарина О.В., Артюхов В.Г., Алабовский В.В. Влияние гистамина на функциональные свойства нейтрофилов и интенсивность процесса пероксидного окисления нейтрофилов в крови доноров // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2008. - №1. - С. 93-96], в которых при изучении влияния гистамина, используемого в различных концентрациях, на окислительный метаболизм ПМЛ, было выявлено, что гистамин дозозависимо изменяет активность НАДФН-оксидазной и миелопероксидазной ферментных систем ПМЛ.

Выраженные различия ХЛ крови больных, сенсибилизированных энтеротоксинами стафилококка, и здоровых доноров открывают возможность применения метода стимулированной сульфатом бария люминол-зависимой ХЛ в качестве диагностического теста для определения специфической сенсибилизации организма к бактериальным аллергенам, в частности к Staphylococcus aureus и другим бактериальным аллергенам.

Рекомендуемая концентрация комплексного препарата бактериальных антигенов Staphylococcus aureus для диагностики специфической сенсибилизации организма к данному микроорганизму составляет 5×10⁴ микр. кл./мл. Если на концентрации бактериального антигена 5×10⁴ микр. кл./мл ИП выше 3,0, следует, что у пациента имеется сенсибилизация к стафилококковым антигенам.

Аналогичные результаты были получены при использовании в качестве бактериальных антигенов и других микроорганизмов: Klebsiella pneumonia (см. Табл. 2), Pseudomonas aerogenosa, Е. Coli.

Известно, что микроорганизмы способны оказывать праймирующее действие на ПМЛ крови у пациентов гнойными инфекционными заболеваниями (в частности, абсцесс, флегмона, синдром диабетической стопы, нагноение ран и т.д.) [Е.А. Усанова, Ю.П. Сюсюкин, Е.Э. Арутюнова, Ю.В. Балякин. Праймирующее действие Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes на полиморфно-ядерные лейкоциты крови при острых гнойно-воспалительных заболеваниях. // Сборник тезисных докладов научно-практической конференции, посвященной 40-летию МБФ «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - 2003. - С. 94; Е.А. Усанова, Ю.В. Балякин. Изменение фагоцитарной активности и эффект прайминга полиморфно-ядерных лейкоцитов крови при синдроме диабетической стопы. // Вестник РГМУ. Материалы Пироговской конференции студентов и молодых ученых - 2004. С. 47]. У таких пациентов значения ИП также выше значений здоровых доноров, так как микроорганизмы, вызвавшие воспалительный процесс, оказывают предстимулирующее действие на ПМЛ крови.

Для дифференциальной диагностики специфической сенсибилизации к бактериальным аллергенам или выявления наличия воспалительного инфекционного процесса (гнойно-воспалительных процессов) выполняются следующие действия:

1. Для исследования используется гепаринизированная венозная кровь (концентрация гепарина - 50 ЕД/мл) объемом 0,5 мл.

2. Непосредственно перед проведением исследования во взятых образцах цельной крови определяется количество и жизнеспособность лейкоцитов.

3. Из образцов крови отбирают объемы, содержащие 1×10⁶ лейкоцитов (объем крови составляет около 95-100 мкл), и доводят их до 0,68 мл средой Хенкса.

4. К полученным образцам добавляют 0,01 мл растворенного в среде Хенкса антигистаминного препарата тавегила в конечной концентрации 1,1×10^-4 M, после чего пробы инкубируют в течение 10 минут при 37°С при постоянном перемешивании.

5. Затем в пробы крови вносят 0,01 мл комплексного бактериального препарата антигенов и производят повторную инкубацию в течение 45 минут в тех же условиях. В качестве контрольных используют пробы, содержащие 0,01 мл раствора тавегила. Состав контрольной пробы: 100 мкл крови, 0,01 мл раствора тавегила, 0,01 мл физиологического раствора, 0,68 мл среды Хенкса.

6. После инкубации измеряют интенсивность ХЛ проб. В качестве активатора свечения используют люминол и регистрируют суммарную секрецию активных форм кислорода.

7. В кювету хемилюминометра вносят 0,7 мл пробы после инкубации и 0,15 мл активатора (2 мМ). Далее измеряют уровень спонтанной ХЛ. После регистрации спонтанной ХЛ добавляют 0,15 мл стимулятора свечения - сульфата бария (2 мг/мл) и регистрируют уровень стимулированной ХЛ. Измерение ХЛ крови проводится в режиме постоянного перемешивания при температуре 37°С.

8. С помощью компьютерной программы BLM-Obrab определяются следующие параметры хемилюминесценции: интенсивность спонтанной ХЛ, интенсивность максимальной ХЛ, время достижения максимальной вспышки ХЛ, площадь под кривой ХЛ (Sхл), которая отражает светосумму ХЛ. Проведенные нами контрольные исследования показывают, что ошибка определения параметров кривой ХЛ не превышает 0,5%.

При оценке влияния тестируемого агента (тавегила) на ХЛ крови рассчитывают индекс соотношения площадей (ИП), представляющий собой отношение Sхл опытной пробы (с тавегилом в смеси с бактериальным антигеном) к Sхл контрольной пробы, содержащей тавегил (Sхл опыт/Sхл контр.). По величине ИП люминол-зависимой ХЛ судят о наличии сенсибилизации организма к бактериальным антигенам.

Если после инкубации с тавегилом в смеси с комплексным препаратом бактериальных антигенов ИП возвращается к нормальным значениям, близким к таковым у здоровых добровольцев, следует, что у пациента имеется специфическая сенсибилизация к бактериальным аллергенам.

Если после инкубации с тавегилом в смеси с комплексным препаратом бактериальных антигенов значение ИП практически не изменяется (с точностью до 5%), можно заключить, что у пациента отсутствует специфическая сенсибилизация к бактериальным антигенам.

Пример 1. Дифференциальная диагностика специфической сенсибилизации к бактериальным антигенам или выявления наличия гнойно-воспалительного процесса в организме

Больная А., 45 лет (история болезни №1050/11-5970/04). Клинический диагноз: Бронхиальная астма, инфекционно-аллергическая форма, средней тяжести течения, фаза обострения при поступлении, фаза ремиссии при выписке. Хронический бронхит, фаза обострения при поступлении, фаза ремиссии при выписке. Хронический полипозный риносинусит. Исследование проводилось на биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606-01 (СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия) в фазу ремиссии основного заболевания.

Подготовка проб проводилась по описанной выше методике. Получены следующие показатели ИП люминол-зависимой ХЛ для исследуемых бактериальных антигенов.

Заключение: Выявлено выраженное праймирующее действие бактериальных антигенов Staphylococcus aureus на ПМЛ крови пациента.

Результаты дифференциальной диагностики специфической сенсибилизации к стафилококковым энтеротоксинам или наличия гнойно-воспалительного процесса, в развитии которого важное значение имеет микроорганизм Staphylococcus aureus, представлены ниже.

Выявлено снижение ИП_Т (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом) относительно индекса ИП (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами) на 30%. То есть значение отношения (ИП_Т:ИП)=0,7. С нашей точки зрения, увеличение ИП после предынкубации проб крови с комплексным препаратом бактериальных антигенов Staphylococcus aureus у пациентов, сенсибилизированных энтеротоксинами стафилококка, происходит вследствие действия на нейтрофилы медиаторов (в частности, гистамина), высвобождающихся из базофилов при образовании на их поверхности иммунного комплекса аллерген - IgE, где в качестве аллергена выступают энтеротоксины стафилококка. Поэтому добавление антигистаминного препарата тавегила снижает ИП, приближая его к показателю ИП здоровых доноров.

Диагноз: выявлена специфическая сенсибилизация к бактериальным антигенам Staphylococcus aureus у данного пациента.

Пример 2. Больная К., 68 лет (история болезни №1711/14С/6677/14). Клинический диагноз: Инсулиннезависимый сахарный диабет. Гнойно-воспалительное заболевание в области стопы (синдром диабетической стопы). Поражение стопы IV степени. Увеличение глюкозы в крови >8 ммоль/ л. Сопутствующие заболевания: Бронхиальная астма, смешанная форма, средней тяжести течения, фаза ремиссии. Хронический бронхит, фаза ремиссии. Хронический полипозный риносинусит.

Исследование проводилось на биохемилюминесцентном анализаторе БЛМ 3606-01, как и для примера 1, в фазу ремиссии основного заболевания.

Подготовка проб проводилась по описанной выше методике. Получены следующие показатели ИП люминол-зависимой хемилюминесценции для исследуемых бактериальных антигенов: Staphylococcus aureus - ИП=4,15 отн.ед.; Staphylococcus aureus + тавегил - ИП_Т=3,94 отн. ед.

Выявлено увеличение ИП пациента на 95% относительно показателя ИП здоровых доноров (ИП здоровых доноров равен 2,13±0,27) после предынкубации проб крови с комплексным препаратом антигенов Staphylococcus aureus в дозе 5×10⁴ микр. кл./мл. Воздействие тавегила не оказывает значительного влияния на ИП (снижение ИП_Т (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом) относительно индекса ИП (индекса, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами на 5%, то есть значение отношения (ИП_Т:ИП)=0,95. Это свидетельствует об отсутствии специфической сенсибилизации организма к антигенам Staphylococcus aureus.

Диагноз: специфическая сенсибилизация организма к АГ Staphylococcus aureus отсутствует. В развитии гнойно-воспалительного процесса участвует Staphylococcus aureus.

Таким образом, дифференциацией специфической сенсибилизации к бактериальным аллергенам от бактериальной инфекции служит значение ИП. Как видно из данных, представленных в Табл. 1 и проведенных ранее исследований, ИП повышается как при наличии гиперчувствительности к бактериальным антигенам, так и при бактериальной инфекции. Поскольку в сенсибилизированном организме после контакта со специфическим аллергеном происходит массивное высвобождение из базофилов (и тучных клеток) биологически активных веществ, в частности, гистамина, то дифференциальная диагностика между гнойно-воспалительным процессом, вызванным бактериальной инфекцией и гиперчувствительностью к бактериальным аллергенам, может быть проведена путем добавления в среду инкубации антигистаминного препарата, например тавегила.

Нами было показано, что при предынкубации проб крови с тавегилом ИП_Т (индекс, вычисленный для пробы с бактериальными антигенами в смеси с тавегилом) значительно не изменялся у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями для дозы 5×10⁴ микр. кл./мл Staphylococcus aureus (ИП_Т снизился на 5% относительно ИП, вычисленного для пробы с бактериальными антигенами; значение отношения (ИП_Т:ИП)=0,95). Тавегил уменьшил ИП_Т для проб крови больных с гиперчувствительностью к данным бактериальным антигенам на 30% ((ИП_Т:ИП)=0,70). У больных с астматической триадой без гиперчувствительности к золотистому стафилококку подобная инкубация не привела к изменению ИП_Т.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о достижении технического результата в части расширения функциональных возможностей способа - возможности определения не только сенсибилизации к тем или иным бактериальным антигенам, но и выявления бактериального воспаления в организме пациента, в том числе скрытой бактериальной инфекции.

Изобретение относится к области медицины и касается способа дифференциальной диагностики in vitro специфической сенсибилизации пациента к бактериальным аллергенам. Сущность способа состоит в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата, содержащего бактериальные антигены, и сравнении показателей люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) с одноименными показателями, полученными для здорового организма. В отобранную кровь пациента вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие (0,95-1,05)×10⁶ лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови. Тестируемый препарат бактериальных антигенов или смесь тестируемого препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил и контрольный препарат в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови и их инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°С в течение 45 минут. Затем в инкубированные пробы вводят активатор люминол в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанного активатора, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанного активатора, причем измерения ХЛ проводят при постоянном перемешивании при температуре 37°С в течение 45 минут с получением временных зависимостей уровня ХЛ. Вычисляют индексы ИП по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов, соответственно, по которым диагностируют специфическую сенсибилизацию к бактериальным антигенам. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ дифференциальной диагностики in vitro специфической сенсибилизации пациента к бактериальным аллергенам, состоящий в отборе и подготовке венозной крови, введении тестируемого препарата, содержащего бактериальные антигены и сравнении показателей люминол-зависимой хемилюминесценции (ХЛ) с одноименными показателями, полученными для здорового организма,
отличающийся тем, что
в отобранную кровь пациента вводят антикоагулянт, формируют образцы, содержащие (0,95-1,05)×10⁶ лейкоцитов, и доводят их раствором Хенкса до объема 0,69 мл с получением проб крови,
тестируемый препарат бактериальных антигенов или смесь тестируемого препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил, и контрольный препарат в количестве 0,01 мл вводят в полученные пробы крови, и их инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут, затем
в инкубированные пробы вводят активатор люминол в количестве 2 мМ и хемилюминометром измеряют уровень спонтанной ХЛ для указанного активатора, после чего в те же пробы вводят стимулятор свечения - сульфат бария в количестве 2 мг/мл, и регистрируют уровень стимулированной ХЛ также для указанного активатора, причем измерения ХЛ проводят при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 45 минут с получением временных зависимостей уровня ХЛ, далее
вычисляют индексы ИП по выражению ИП=Sба/Sк, где Sба; Sк - площадь под кривыми временной зависимости уровня спонтанной и стимулированной ХЛ для тестируемого и контрольного препаратов, соответственно, по которым диагностируют специфическую сенсибилизацию к бактериальным антигенам.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат антигенов Staphylococcus aureus разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×10⁴ микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,25 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора, диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Staphylococcus aureus.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестируемый препарат антигенов Klebsiella pneumonia разводят в физиологическом растворе и вводят в пробы крови в количестве 5×10⁴ микр. кл/мл, и при индексе ИП выше 3,78 относительно индекса ИП для контрольного препарата в виде физиологического раствора, диагностируют наличие сенсибилизации организма к антигенам Klebsiella pneumonia.

4. Способ по любому пп. 1-3, отличающийся тем, что при тестировании смеси препарата бактериальных антигенов с противоаллергическим препаратом тавегил сначала в пробы крови вводят упомянутый препарат, растворенный в растворе Хенкса в конечной концентрации 1,1×10^-4 M, после чего пробы инкубируют при постоянном перемешивании при температуре 37°C в течение 10 минут, затем одну часть полученных проб используют в качестве контрольных, а другую часть - в качестве тестируемых, для чего в пробы вводят тестируемый препарат бактериальных антигенов и осуществляют повторное инкубирование при том же режиме, а
специфическую сенсибилизацию организма к бактериальным антигенам Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumonia диагностируют при значении отношения (ИП_Т : ИП), меньшем или равном 0,8, где ИП_Т - индекс, вычисленный для пробы бактериальных антигеном в смеси с тавегилом; ИП - индекс, вычисленный для пробы бактериальных антигенов.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хемилюминометр представляет собой биохемилюминесцентный автоматический анализатор БЛМ 3606М-01 с компьютерной программой BLM- Obrab, производства СКТБ «Наука» КНЦ СО РАН, Россия.