СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/52 G01N21/76 

Изобретение относится к области медицины, а именно к вопросам проверки биологических свойств препаратов крови, и может быть использовано для лабораторного определения противовоспалительных свойств препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения - ИГВВ.

Известно, что препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения при клиническом применении могут проявлять противовоспалительное действие. Так, ИГВВ могут использоваться для купирования системного воспалительного ответа [1] и явлений воспалений аутоиммунной и аллергической природы [2, 3]. При этом противовоспалительные эффекты действия ИГВВ обосновываются результатами клинических наблюдений. Препараты иммуноглобулинов человеческих нормальных для внутривенного введения производства разных изготовителей ввиду особенностей технологии получения могут существенно различаться по составу и, соответственно, биологическим свойствам, в том числе и по способности воздействия на воспалительные процессы разной природы [2, 4, 5]. При этом методов лабораторного определения противовоспалительной активности ИГВВ, необходимых для отбора препаратов с целью наиболее эффективного проведения противовоспалительной терапии, не разработано. Сведения о лабораторных методах оценки противовоспалительной активности ИГВВ до их клинического применения, в частности путем воздействия на фагоцитирующие клетки, участвующие в индукции и течении воспалительного процесса, в доступных источниках отсутствуют.

Общепризнано, что в возникновении как местных, так и системных воспалительных реакций ведущими участниками выступают фагоцитирующие клетки, а одним из ведущих механизмов развития воспаления являются процессы активации фагоцитов. Возникающая под влиянием различных инфекционных и других агентов активация фагоцитов сопряжена с продукцией цитокинов: фактор некроза альфа (ФИО), интерлейкинов (ИЛ) - 1, 6, 8 и ряда других, обусловливающих системные проявления воспаления как на уровне организма (повышение температуры, изменения процессов метаболизма и ряда других), так и местно (формирование очагов острого воспаления путем мобилизации в ткани и активации циркулирующих полиморфно-ядерных фагоцитов). Они обусловливают процессы воспалительной тканевой деградации, вызываемые секретируемыми живыми или выделяющимися разрушающимися активированными фагоцитами продуктами - активными формами кислорода (АФК), кислыми гидролазами, лизоцимом и другими [6, 7, 8]. При этом одним из ведущих функционально-метаболических проявлений активации фагоцитов является «взрывообразное» усиление течения процессов кислородзависимого метаболизма («дыхательный взрыв»), сопровождаемое генерацией АФК, накопление которых в клетке является одним из факторов защитного действия фагоцитов, но при поступлении во внешнюю среду в ходе экзоцитоза и при разрушении клеток выступает фактором тканевой воспалительной деструкции [7, 9, 10]. С учетом этого, для снятия острой воспалительной реакции, необходимо снизить уровень активации «островоспалительных» полиморфно-ядерных фагоцитов, что может обеспечить лечебный эффект в виде подавления воспалительного процесса.

Известно, что активация кислородзависимого метаболизма фагоцитов и обусловленная этим процессом непосредственная генерация АФК могут быть выявлены с помощью цитохимического метода - реакции спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), а также в реакции люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). В НСТ-тесте у фагоцитов определяется активация процессов кислородзависимого метаболизма фагоцитов по увеличению активности NADH.H - оксидазы, восстанавливающей нитросиний тетразолий до водонерастворимого диформазана, регистрирующегося в клетке фагоцита при микроскопии [7, 9] или реже - после его экстракции спектрофотометрически [8], а при определении ЛЗХЛ с помощью аппаратов хемилюминометров непосредственную генерацию дающих усиливаемое люминолом сверхслабое свечение АФК [10, 11]. Установлено, что отклонения в интенсивности ЛЗХЛ фагоцитов от нормальных показателей (увеличение, снижение) в достаточной степени соответствуют изменениям степени их активации, одним из ведущих проявлений которой является уровень кислородзависимого метаболизма по результатам НСТ-теста [4, 11]. При этом метод регистрации ЛЗХЛ отличает от определения активности кислородзависимого метаболизма с помощью НСТ-теста простотой и быстротой выполнения (автоматическая регистрация результатов ЛЗХЛ в течение 5 минут).

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка лабораторного метода определения степени противовоспалительного действия различных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения.

Заявляемый метод основан на регистрации спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции с помощью аппаратов хемилюминометров в образцах биологических жидкостей, взятых из очагов острого асептического воспаления, после инкубации с иммуноглобулином для внутривенного введения.

Предлагаемый метод предусматривает выявление степени угнетающего влияния ИГВВ на уровень активации фагоцитов с целью отбора препарата иммуноглобулинов для внутривенного введения для лечения больных с системными и местными воспалительными процессами. Данный метод предполагает инкубацию ИГВВ с суспензией «островоспалительных» полиморфно-ядерных фагоцитов из очага острого асептического воспаления - перитонеальной жидкостью крыс через сутки после внутрибрюшинного введения им 20 мл 8% пептона [7] с последующим определением разницы в уровне ЛЗХЛ суспензий после инкубации с ИГВВ и без таковой (контроль).

Указанная задача достигается за счет того, что к полученным из очага острого асептического воспаления образцам биологической жидкости, содержащих фагоцитирующие клетки и гепарин из расчета 50 ЕД/мл (перитонеальный экссудат, полученный от крыс через 20-26 часов после введения 20 мл 8% стерильного раствора пептона) добавляют ИГВВ в соотношении 50% и инкубируют при комнатной температуре 24 часа. Объем реакционной смеси и плотность содержания в ней фагоцитов могут варьировать; в контрольном образце к фагоцитарной популяции вместо препарата ИГВВ добавляют забуференный физиологический раствор или среду 199. Затем к клеточной суспензии в количестве 0,2 мл добавляют 0,1 мл раствора 10^-5 М люминола (5-амино,2-3-дегидро-4-фталазиндион) в физиологическом растворе рН 7,2 и суспензию помещают в термостатируемую (+37°С) камеру хемилюминомера. Уровень ХЛ регистрируется в течение 5 минут и выражается в виде светосуммы (суммарное количество световых импульсов за 10 минут регистрации в условных единицах - у.е.), вычисляют разность светосумм испытуемых образцов (с ИГВВ) и контрольного (без добавления препаратов); снижение светосумм на 50% и более свидетельствует о наличии подавляющего влияния на активность островоспалительных фагоцитов.

Применение предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В ходе проведенных нами исследований с помощью разработанного метода проведено изучение влияния ИГВВ "Иммуновенин" в концентрации 50% на уровень активации островоспалительных полиморфно-ядерных фагоцитов перитонеальной жидкости крыс, полученной через 24 часа после внутрибрюшинного введения 20 мл 8% стерильного раствора пептона. Перитонеальную жидкость крыс с добавлением 50 ЕД/мл гепарина (содержание лейкоцитов 12,5×10⁹/л) после инкубации в течение 24 часов при комнатной температуре в количестве 0,5 мл вносили в пластиковые пробирки на 2 мл и добавляли в объеме 0,5 мл препарата "Иммуновенин" (в контрольной препарат заменен адекватным объемом среды 199) и инкубировали в течение 24 часов при комнатной температуре. К клеточной суспензии в количестве 0,2 мл добавляют 0,1 мл раствора 10^-5 М люминола в физиологическом растворе рН 7,2 и суспензю помещают в термостатируемую (+37°С) камеру хемилюминомера. В течение 5 минут проводят определение уровня ЛЗХЛ.

В нашей работе светосумму ЛЗХЛ определяли на приборе ХЛ-003 с компьютерным режимом регистрации. Параллельно в материале из пробирок, исследуемых и контрольных образцов, определяли спонтанную активацию кислородзависимого метаболизма фагоцитов в НСТ-тесте общепринятыми методами. Результаты регистрировали микроскопией и выражали вычислением процентов активированных в НСТ-тесте клеток и вычислением цитохимического индекса активации [12]. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 Уровень ЛЗХЛ и спонтанной активации кислородзависимого метаболизма в тесте НСТ спонтанный островоспалительных перитонеальных нейтрофилов крыс после предварительной суточной инкубации клеток с ИммуновениномИммуновенин в концентрацииНСТ спонтанныйСветосумма ЛЗХЛ (условные единицы)%индекс активации50% (n=6)52,46±3,18*2,08±0,11*0,62±0,05*Контроль (без ИВ) (n=6)72,72±6,742,84±0,369,00±0,63Примечание: * - различие показателей достоверно с контролем (без препарата) при р<0,05.

Как следует из материалов примера, Иммуновенин оказывает на уровень активации «остро-воспалительных» полиморфно-ядерных фагоцитов угнетающее влияние, причем интенсивность изменений определения генерации фагоцитами АФК по результатам реакции ЛЗХЛ соответствуют таковой при определении активации в клетках кислородзависимого метаболизма общепринятым методом с помощью НСТ-теста. При этом доза препарата в пересчете из экспериментальных (по принятой фармакологической практике в опытах in vitro лечебные дозы препаратов ввиду возможной нейтрализации или метаболизации последних в организме и с учетом иных факторов десятикратно завышаются) соответствуют применяемым при курсовом лечении больных с признаками выраженной острой воспалительной реакции (тяжелые травмы, септические состояния и другие) [2, 5, 13].

Пример 2.

Предлагаемым методом проведена сравнительная проверка влияния коммерческих ИГВВ разных производителей - Иммуновенина, Хумоглобулина и Пентаглобина, на уровень активации островоспалительных полиморфно-ядерных фагоцитов перитонеальной жидкости крыс в высоких, «подавляющих активность» концентрациях - 50% объема реакционной среды. У суспензий фагоцитов перитонеальной жидкости (плотность клеток 11,8×10⁹/л) после 24-часовой инкубации с препаратами ИГВВ в концентрации 50% исследовалась интенсивность ЛЗХЛ, как это описано в Примере 1. Результаты исследования приведены в таблице 2).

Таблица 2Уровень ЛЗХЛ "остро-воспалительных" перитонеальных нейтрофилов крыс после предварительной суточной инкубации клеток с Иммуновенином, Хумоглобулином и Пентаглобином в концентрации 50%ПрепаратыСветосумма ЛЗХЛ (условные единицы)Иммуновенин серия 16 (n=3)1,09±0,38***Хумоглобулин (n=3)4,33±0,66*Пентаглобин (n=3)2,66±0,10*Контроль (без препаратов) (n=3)9,25±0,15Примечание: различие показателей достоверно (р<0,05) с контролем (без препаратов) - *, между показателями для разных препаратов - **.

Как видно из приведенных данных, ИГВВ разного производства в равных концентрациях различаются выраженностью подавляющего действия на генерацию АФК «островоспалительными» фагоцитами. Таким образом, с помощью заявляемого способа может быть выявлена степень влияния разных препаратов иммуноглобулинов на уровень активации фагоцитов в ходе воспалительного процесса.

Литература

1. Хвойнов Д.В., Викторов В.В., Галеев Ф.С.и др. Применение препарата "Иммуновенин" как компонента интенсивной терапии системного воспалительного ответа в детской неврологии. // Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение. Часть 1. Уфа, 2005, С.24-28.

2. Анастасиев В.В. Применение иммуноглобулинов: Обзор. - Н. Новгород: Изд-во НГМИ. - 1993. - 27 с.

3. Анастасиев В.В. Разработка технологии получения иммуноглобулинов нового поколения для терапии инфекционных и аутоиммунных заболеваний человека: Автореф. дис.... д-ра биол. наук. - Москва, 1997. - 49 с.

4. Алехин Е.К., Богданова А.Ш., Плечев В.В., Фархутдинов P.P. Влияние лекарственных препаратов на процессы свободно-радикального окисления (Справочник). Уфа. 2002. 287 с.

5. Сибиряк С. В., Садыков Р.Ф., Магазов Р.Ш., Сергеева С.А. Иммуномодуляторы: справочник для врачей. - Уфа, ГУП "Иммунопрепарат", 1999. - 145 с.

6. Боун Р. Сепсис и септический шок. / Курс лекций: Актуальные проблемы анестезиологии и реаниматологии. IX Европейский конгресс анестезиологов, 2-7 октября 1994 г. - Архангельск-Трамсе, 1995. - С.125-139.

7. Медведев Ю.А. Неспецифические механизмы и факторы иммунитета. / Ю.А.Медведев, В.В.Сперанский, С.Н.Хунафин, - Уфа, 1994. - 32 с.

8. Хаитов Р.М. Экологическая иммунология. / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, X.И.Истамов. - М., ВНИРО. - 1995. - 220 с. Хаитов Р.М. Экологическая иммунология / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин, X.И.Истамов. - М., ВНИРО. - 1995. - 220 с.

9. Маянский А.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. / А.Н.Маянский, Д.Н.Маянский // Новосибирск: Наука, 1983. - 254 с.

10. Фархутдинов P.P., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободно-радикального окисления в биологии и медицине. - Уфа. - 1995. - 92 с.

11. Фархутдинова Л.В., Медведев Ю.А., Алсынбаев М.М. Диагностика и коррекция иммунной реактивности детей с заболеваниями респираторного тракта при различных вариантах нарушения функционального резерва фагоцитирующих клеток крови. Уфа, 2005. - 133 с.

12. Петров Р.В. Оценка иммунного статуса человека при массовых обследованиях. / Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, Б.В.Пенегин. // Методические рекомендации для научных работников и врачей практического здравоохранения (разработаны сотрудниками Института иммунологии МЗ России). - Иммунология. - 1992. - № 6. - С.51-52.

13. Гизатуллин Р.Х., Галеев Ф.С., Халикеева Е.Ю., Вакеев Б.В. Комплексное лечение инфекционно-воспалительных осложнений сочетанных и множественных повреждений с применением иммуновенина. // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии. Материалы Всероссийской конференции молодых ученых. Уфа, 2004, с.201-203.

Изобретение относится к области медицины, а именно к определению биологических свойств препаратов крови. Изобретение представляет собой способ определения противовоспалительного действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, заключающийся в том, что к образцам биологических жидкостей, полученным из очага острого асептического воспаления и содержащим «островоспалительные» полиморфно-ядерные фагоциты, добавляют иммуноглобулины для внутривенного введения в концентрации 50% объема реакционной среды, определяют интенсивность спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции образцов и вычисляют разницу светосумм хемилюминесцентного ответа в сравнении с контролем и снижение разницы светосуммы хемилюминесценции в присутствии препарата ИГВВ на 50% и более свидетельствует о наличии противовоспалительного действия. Изобретение позволяет выявить уровень подавляющего влияния препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на уровень активации «островоспалительных» фагоцитов с целью отбора препаратов для лечения больных с негативными проявлениями воспалительных процессов местного и системного характера. 2 табл.

Способ определения противовоспалительного действия препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения, заключающийся в том, что к образцам биологических жидкостей, полученным из очага острого асептического воспаления и содержащим «остро-воспалительные» полиморфно-ядерные фагоциты, добавляют иммуноглобулины для внутривенного введения в концентрации 50% объема реакционной среды, и после суточной инкубации определяют интенсивность спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции образцов и вычисляют разницу светосумм хемилюминесцентного ответа в сравнении с контролем, снижение которой на 50% и выше свидетельствует о наличии подавляющего влияния на воспалительную активность.