СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗЕРВА РЕАКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ (ОКСИДАНТНОГО ПОТЕНЦИАЛА) Российский патент 2012 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к биологии, медицине, в частности к лабораторной диагностике, иммунологии, и может быть использовано для оценки реактивности нейтрофилов (оксидантного потенциала) у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями (ГВЗ).

Известен ряд способов оценки резерва реактивности нейтрофилов под влиянием различных экзогенных стимулов: микробных тест-культур, частиц латекса инертных или нагруженных бактериальными антигенами и т.д. [1]. Наиболее близкий способ - прогнозирование неблагоприятного течения флегмоны при определении спонтанной хемилюминесценции (ХЛ) сразу и через 2 часа после инкубации крови с культурой стафилококка [2]. Однако трактовка результатов весьма затруднительна, поскольку помимо изменения собственного потенциала клеток, происходит воздействие экзогенного стафилококка, кроме того, предлагается определять дополнительно активность ингибиторов трипсина и холинэстеразы. Аналогом наших исследований является работа С.А. Борисова, в которой проводятся исследования окислительно-метаболической функции и реактивности мигрирующих в крови и тканевых нейтрофилов [3].

Предложен метод оценки резерва реактивности нейтрофилов (оксидантного потенциала). Проводят определение разности светосумм (РСС) спонтанной хемилюминесценции (ХЛ) цельной разведенной крови, измеренной сразу после взятия крови и через 4 часа. Данный временной интервал установлен как допустимый при экспозиции крови in vitro до проведения исследований [4]. Известно, что основной вклад в ХЛ цельной разведенной крови вносят нейтрофильные гранулоциты [5]. За норму значений РСС принят 1%-99% процентильный интервал общего диапазона значений контрольной группы здоровых доноров, который составил: 1% - 0,95 у.е., 99% + 10,37 у.е. Значения РСС ниже 1% процентильного интервала у больных с ГВЗ наблюдали в 28,6% случаев, что свидетельствовало о снижении резерва реактивности нейтрофилов вследствие ряда факторов (гиперактивация микробными антигенами in vivo, деактивация вследствие недостатка гуморальных активационных или повышении супрессорных факторов). Значения РСС, превышающие 99% процентильный интервал были выявлены в 26,8%, что обусловлено процессом оксидантного стресса, альтерацией клеток и развитием воспалительно-деструктивного процесса. Это является одним из механизмов патогенеза у больных с тяжелыми ГВЗ и обуславливает формирование вторичного иммунодефицитного состояния. Оценка РСС позволяет оценить реактивность нейтрофилов и проводить соответствующую иммунотропную, противовоспалительную, антиоксидантную терапию.

Данный тест имеет определенные преимущества перед индуцированной хемилюминесценцией:

- позволяет исследовать резерв реактивности нейтрофилов без применения микробной тест-культуры, что упрощает проведение исследований;

- не требует подбора этиотропной микробной тест культуры.

В настоящее время тест апробирован у больных с различными формами пиодермии, хроническим остеомиелитом, флегмоной.

Пример 1. Больной Б. 24 лет. Диагноз: хронический остеомиелит L5 позвонка, свищевая форма. Спонтанная ХЛ, измеренная сразу после взятия крови, составила 2,3 у.е.; через 4 часа после инкубации крови in vitro 40,18 у.е, РСС составила +37,88 у.е. Регистрируемый оксидантный стресс весьма характерен для тяжелых форм хронического остеомиелита, поскольку процессы свободнорадикального и перекисного окисления считают одним из звеньев патогенеза этого заболевания.

Пример 2. Больная Ф., 23 лет. Диагноз: Хроническая пиодермия. Длительность заболевания 6 лет.

- Стадия обострения (инфильтраты в области лица с гнойным отделяемым): спонтанная ХЛ, измеренная сразу после взятия крови, составила 33,82 у.е.; через 4 часа после инкубации крови in vitro 11,7 у.е.. РСС составила -22,12 у.е.. Отрицательные значения РСС объясняются значительной активацией нейтрофилов микробными антигенами in vivo (высокие значения спонтанной ХЛ, измеренной сразу после взятия крови) и отсутствием дополнительного резерва нейтрофилов.

- Стадия ремиссии. Значения РСС составили -2,07. Значения РСС в динамике значительно возросли, однако остаются ниже значений в контрольной группе доноров, что объясняется сохраняющейся у больной деактивацией нейтрофилов и является одной из причин длительного хронического гнойно-воспалительного процесса.

Проведение исследования.

Венозная кровь в объеме 3,0 мл отбирается в пластиковую пробирку с гепарином (из расчета 100 ед/мл). Раствор люминола готовят на диметилсульфоксиде (ДМСО) (17,7 мг лю-минола на 10,0 мл ДМСО). Рабочий раствор люминола готовят из расчета 10,0 мл стерильного физиологического раствора и 0,01 мл люминола, раствор предварительно прогревается в термостате при 37°С. К 2,0 мл рабочего раствора добавляется 100 мкл гепаринизированной крови (коэффициент разведения крови - 21). Исследование крови осуществляется сразу после забора. Измерение светосуммы спонтанной хемилюминесценции проводят на приборе ХЛМ-003 в следующем режиме: время исследования - 10 мин, кювета термостатируемая - 37°С. Дальнейшее хранение крови происходит при комнатной температуре (18-25°С). При истечении 4-х часов кровь перемешивают ресуспензированием, после чего проводят повторное измерение светосуммы спонтанной ХЛ. Расчет разности светосуммы (РСС) проводят как разность измерений через 4 часа и измерения, проведенного сразу после забора крови.

ЛИТЕРАТУРА

1. Якуба Н.И., Андрущук А.А., Скрипка Л.И., Чернушенко Е.Ф. Способ определения иммунологической реактивности организма. Патент на изобретение №1629848.

2. Юнусходжаев Э., Бажанов Н.Н., Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. и др. Способ прогнозирования неблагоприятного течения флегмоны. Патент на изобретение №1553900.

3. Борисов С.А. Сидорова Л.Д., Цырендоржиев Д.Д. и др. Функциональная активность фагоцитов легких и состояние микроокружения в очаге воспаления у больных хронической обструктивной болезнью легких // Сибирский Консилиум. - 2004. -№.2. - С.57-61.

4. Фархутдинов P.P. Исследование хемилюминесценции биологического материала и оценка антиокислительной активности на приборе ХЛМ -003. Методические рекомендации. Уфа, 2005, 24 с.

5. Земсков В.М. Хемилюминесценция крови. Методические рекомендации. 1988.

Изобретение относится к биологии, медицине, в частности к лабораторной диагностике, иммунологии, и описывает способ определения резерва реактивности (оксидантного потенциала) нейтрофилов, в котором проводят измерение светосуммы спонтанной хемилюминесценции цельной разведенной крови в растворе люминола сразу после взятия крови и через 4 часа после ее инкубации, затем проводят расчет разности светосуммы (РСС) как разность измерений через 4 часа и измерения, проведенного сразу после забора крови, при этом за норму значений РСС принимают 1%-99% процентильный интервал общего диапазона значений контрольной группы здоровых доноров; значения РСС ниже 1% процентильного интервала свидетельствуют о снижении резерва реактивности нейтрофилов, значения, превышающие 99% процентильный интервал, свидетельствуют о процессе оксидантного стресса, альтерации клеток и развитии воспалительно-деструктивного процесса. Данное изобретение позволяет оценить функциональную активность нейтрофилов (феномен деактивации и гиперактивации) без применения микробной тест-культуры, что упрощает проведение исследований и не требует подбора этиотропной микробной культуры, поскольку изменение ХЛ происходит под воздействием эндогенных субстанций, включая воздействие микроорганизмов и их дериватов у конкретного больного. 2 пр.

Способ определения резерва реактивности (оксидантного потенциала) нейтрофилов, характеризующийся тем, что проводят измерение светосуммы спонтанной хемилюминесценции цельной разведенной крови в растворе люминола сразу после взятия крови и через 4 ч после ее инкубации, затем проводят расчет разности светосуммы (РСС) как разность измерений через 4 ч и измерения, проведенного сразу после забора крови, при этом за норму значений РСС принимают 1-99% процентильный интервал общего диапазона значений контрольной группы здоровых доноров; значения РСС ниже 1% процентильного интервала свидетельствуют о снижении резерва реактивности нейтрофилов, значения, превышающие 99% процентильный интервал, свидетельствуют о процессе оксидантного стресса, альтерации клеток и развитии воспалительно-деструктивного процесса.