Способ консервации периферического нерва Советский патент 1988 года по МПК A01N1/00 

со со

Изобретение относится к области медицины и касается консервации тканей.

Цель изобретения - повышение жизнеспособности препарата.

Способ осуществляют следующим образомi

При строгом соблюдении правил асептики и антисептики осуществляют доступ к артерии, ветви которой кро- воснабжают нервные стволы, подлежащие подготовке к аллотрансплантации. В стенке артерии делают небольшой надрез, через который в ее просвет вводят иглу, соединенную с аппаратом для инъекции жидкостей. Делают надре стенки лежащей рядом вены. Производя инъекцию-выделенной артерии раствором, содержащим, г/л: Диметилсульфоксид 80-120 45-50 Гидрокортизон 0,05-0,07 Инсулин 50-70 ЕД Физиологический раствор .До 1000 мл Этот раствор должен быть охлажден до . Инъекцию проводят медленно, в течение 10-15 мин, давление во время инъекции, контролируемое маномет- ром, не должно превышать 120 мм рт.с Инъекцию заканчивают при вытекании из разреза в вене криозащитной среды без примеси крови.

После окончания инъекции артерия и вена дистальнее кончика иглы перевязываются, иглу аппарата извлекают из просвета артерии. Время экспозици раствора в сосудах.,нерва составляет 30 мин.

С соблюдением асептики и антисептики иссекают инъецированные нервы в течение 10-15 мин и переносят их в криозищитную среду, содержащую, г/л: Глицерин120-180

Сыворотка крови150-200

Глюкоза45-50

, Гидрокортизон0,Ю5-0,07

Инсулин50-70 ЕД

Среда 199До 1000 мл

Инкубацию в данной среде продолжают в течение 60-80 мин, при С, после чего нервные стволы переносят в упаковку, заполненную криозащитной средой этого же состава, которую

герметизируют и помещают в жидкий азот при -196 С.

Оценку жизнеспособности нервных стволов производят общеизвестными методами (трансплантация в дефект одноименного аллонерва, трансплантация в межмышечный дефект, культивирование in vitro, люминесцентная микроскопия импрегнационные методики, изучение расщипанного нерва в фазовом контрасте и др. (после их быстрого отогревания в водяной бане при +42°С и отмывания криозащитной среды в растворе Хенкса в течение 30 мин).

Проверку аллотрансплантатов и применяемых для их обработки растворов на стерильность производят согласно инструкции по бактериологическому контролю консервированной крови, ее компонентов, препаратов консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов.

Пример 1. Четырех собак массой 12-15 кг умерщвляют при помощи внутривенного введения гексенала. Через 3 ч после гибели животных с помощью аппарата Боброва производят инъекцию задних конечностей через брющную аорту охлажденной до 4°С средой, содержащей 100 г диметилсуль- фоксида, 47,5 г глюкозы, 0,06 г гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл.

Через 30 мин иссекают седалищные нервы и инкубируют их в течение 70 мин в охлажденной до +4°С среде, содержащей 150 г глицерина, 175 г сыворотки крови (собачьей), 47,5 г глюкозы, 0,06 г гидрокортизона, 60 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл.

Нервы переносят в контейнер, заполненный средой того же состава. Контейнер герметизируют и помещают в жидкий азот при -196°С.

Через 4 мес. хранения нервы размораживают в водяной бане при +42 С, отмывают в растворе Хенкса в течение 30 мин и их отрезки длиной 6 см трансплантируют в дефект седалищных нервов восьми экспериментальных co6aKi Через 1-3 мес. после операции собак-реципиентов забивают и оценивают жизнеспособность трансплантатов.Результаты исследования сравнивают с результатами, полученными при использовании в качестве трансплантатов нервов, подготовленных к аллотрансплантации по известному методу.

Проведеннь1е исследования показали, что аллонейротрансплантаты сохраняют жизнеспособность подавляющего больщинства соединительнотканных и

невральных клеточных эльментов. Ней- ролеммоциты трансплантированных нервов размножаются не только в периферических, но и в центральных пучках аллотрансплантата. Разрушение пред существующих волокон по типу валлеровской дегенерации происходит по всей толще консервированного нерва с образованием типичных овоидов.

Консервированный нервный ствол служит активным проводником регенерирующих нервных волокон из центрального отрезка нерва реципиента в периферический. Новообразованные осевые цилиндры уже к концу первого месяца после операции прорастают через толщу трансплантата .и в большом количестве проникают в периферический отрезок поврежденного нерва.

Количество сохранивших свою жизнеспособность нейролеммоцитов составило 7Itl,4%.

Проведено сравнение кммуногеннос- ти периферических нервов, подготовленных к аплотрансплантации по предлагаемому и известному способам. Изучены реакции регионарных лимфатичес- ких узлов и селезенки. Выяснено - максимальное число бластов и наибольшая плотность малых лимфоцитов в паракортикапьыых зонах лимфатических узлов отмечены через 1-2 мес после операции, что позволяет трансплантату нерва длительное время служить проводником регенерирующих аксонов из центрального отрезка поврежденного нерва в периферический.

Пример 2. В опыт берут шесть собак массой 10-12 кг. Передние конечности двух животных через 2 ч после эутаназии инъецируют охлажденным до +4°С стерильным раствором, содержащим 80 г диметилсульфок- сида, 45 г глюкозы, 0,05 г гидрокортизона, 50 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл.

Через 30 fflн, соблюдая правила асептики и антисептики, в области предплечий иссекают локтевые и срединные нервы и инкубируют их в течение 60 мин в охлажденной до 4-4°С средеJ содержащей 120 г глицерина, 150 г сыворотки крОБИ, 45 г глюкозы, 0,05 г гидрокортизона, 50 ЕД инсулина,, среды 199 до 1000 мл.

Нервы переносят в контейнер со средой этого же состава, который

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

герметизируют и помещают в жидкий азот при -196°С.

, Через 4 недели хранения нервы отогревают в водяной бане при +42 С, отмывают в растворе Хенкса в течение 30 мин и их отрезки длиной 4 см трансплантируют в экспериментально создаваемые дефекты одноименных нервов четырех собак-реципиентов. Через 1 мес. собак-реципиентов забивают и оценивают состояние нейротрансплан- татов.

Процессы валлеровской дегенерации происходят по периферии и в толще трансплантатов. Последние хорошо реваскз .пяркзованы, причем новообразованные капилляры проникают в глубоко распооюженные пучки. Регениру- рующие осевые цилиндры невротизируют бюнгнеровские ленты трансплантатов, расположенные как в периферических, так и в центральных фасцискулах.

Количество жизнеспособных нейролеммоцитов составило 7110,9%.

Пример 3. В опыт берут щесть собак массой 14-15 кг. Задние конечности двух животных через 4 ч после эут.аназии инъецируют охлажден-. нык до +4°С стерильным раствором, содержащим 120 г диметилсульфоксида, 50 г глюкозы, 0,07 г гидрокортизона, 70 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл. Через 30 мин иссекают мало- и большеберцовые нервы и инкубируют их в течение 80 мин в стерильной охлажденной до среде, содержащей 180 г глицерина, 200 г сыворотки крови, 50 г глюкозы, 0,07 г гидрокортизона, 70 ВД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Нервы переносят в контейнер, заполненный средой этого же состава, который герметизируют и переносят в жидкий азот при .

Через 4 недели хранения образцы с нейротрансплантатами. отогревают в водяной бане при +42°С в течение 30 мин, отмывают в растворе Хенксй и отрезки нервов длиной 6 см трансплантируют в дефекты одноименных : нервов четырех собак-реципиентов.Последних умерщвляют через 1 мес. и оце нивают состояние нейротрансплантатов.

Процессы вторичной дегенерации и невротизации трансплантатов происходят равномерно по всей их толще. Количество жизнеспособных нейролеммоцитов составило 7311,1%.

Пример 4. Двух собак умерщвляют при помощи внутрив(нного введе- 1ШЯ гексенала. Через 4 ч после смерти с соблюдением правил асептики и антисептики производят инъекцию их передних конечностей раствором, содержащим 125 г диметилсульфоксида, 50 г глюкозы, 0,08 г гидрокортизона, 75 ЕД инсулина, физиологического

раствора до 1000 мл. Через 35 мин иссекают средишше нервы и инкубирую их в течение 85 мин в стерильной охлажденной до среде, содержащей 185 г глицерина, 205 г сыворотки крови, 50 г глюкозы 0,08 г гидрокортизона, 75 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Нервы переносят в упаковку, заполненную средой этого же состава, которую гер метизируют и помещают в жидкий азот (-196°С),

Через 6 недель хранения аллонейро трансплантаты размораживают в водяной бане (), отмывают в раство- ре Хенкса в течение 30 мин и трансплантируют в экспериментально созданные дефекты длиной 4 см одноименнь:х нервов четырех собак-реципиентов. Последних умерщвляют через 1 мес.

после операции и оценивают жизнеспособность трансплантатов.

Процессы вторичной дегенерации и невротизации трансплантатов происходят равномерно, по. всей их толще. Количество жизнеспособных нейролем- моцитов составило 7311,9%.

Установлено, что подготовленные по предлагаемому способу аллонейро- трансплантаты могут храниться в сба- лансированном солевом растворе в течение 2 ч после размораживания без существенного снижения жизнеспособности их клеточных элементов. Этого времени достаточно для подготовки

концов поврежденного нерва к анасто- мозированию с трансплантатом.

Пример 5. Донор Р, 35 лет. Смерть наступила в результате ишеми- ческой болезни сердца. Через 8 ч 40 мин произведена инъекция сосудов правой верхней конечности стерильным раствором, охлажденным до +-4 С и содержавшим 100 г диметилсульфоксида 50 г глюкозы, 0,06 г гидрокортизона 60 ЕД инсулина, физиологического раствора до 1000 мл:. Через 30 мин после окончания инъекции с соблюдением асептики и антисептики произве

д

0

5 о

.Q .с

5

0

5

дено иссечение в области предплечья отрезков срединного и локтевого нервов длиной 15 см. Последние помещены на 70 мин в охлажденную до+4 С среду, содержащую 150 г глицерина, 150 г сыворотки крови, 50 г глюкозы, 0,06 г гидрокортизона 60 ЕД инсулина, среды 199 до 1000 мл. Аллонейротранс- плантаты перенесены в упаковки, заполненные средой этого же состава, которые герметизированы и помещены в жидкий азот при -19б с.

Через П мес. упаковка, содержащая срединный нерв, была разморожена в водяной бане при 42 С, аллонейро- трансплантат отмыт в растворе Хсикса в течение 30 мИн и использован для нейропластики дефекта одноименного нерва у больного Л, 25.лет, поступив- щего в клинику с диагнозом травма ножом в верхней трети правого предплечья , полный перерыв срединного нерва.

На операции был замещен травматический дефект срединного нерва консервированным по предлагаемому способу трансплантатом одноименного нерва длиной 5 см.

Контрольный осмотр через 1 год после проведения операции выявил восстановление чувствительности в зоне, иннервируемой срединным нервом, до степени Sj, восстановление функции мышц передней поверхности предплечья до степени М, мыщд кисти - до степени Mj. По данным электромиографии электрическая активность мышц правого предплечья и кисти достоверно не отличалась от таковой на здоровой конечности. При пробе Минора отмечено полное восстановление потоотделения на пальцах и ладони в области, иннервируемой срединным нервом, что свидетельствует об успешной регенерации срединного нерва.

Подготволенные по предлагаемому способу аллонейротрансплантаты были использованы для пластики 6 срединных и 3 локтевых нервов у 8 больных. Величина дефектов нервных стволов составила 5-7 см (у пяти больных) и 10-20 см (у трех больных). Изучение отдаленных результатов операций показано, что положительный результат получен У шести больных. Два неудов- летвор.хгельных результата не связаны с применением предложенного способа, а явились следствием чрезмерно больших дефектов (более 12 см) и грубого рубцового перерождения окружающих тканей до операции.

Использование изобретения позвот лит восстановить чувствительность и двигательную функцию в зоне, инерви- руемой поврежденным нервом.

Формула изо

р е т е н и я

Способ консервации периферического нерва путем помещения в защитную среду, содержащую глицерин, сыворотку ,г крови и среду 199 с последующим замораживанием, отличающий - с я тем, что, с целью повышения жизнеспособности препарата, перед помещением в защитную среду производят 20 инъекцию сосудов нерва раствором.

содержащим диметилсульфоксид, глюкозу, гидрокортизон, инсулин, физраст ,вор при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

0

г 0

80-120 45-50 0,05-0,07 50-70 ЕД До 1000 мл.

Диметилсульфок сид

Глюкоза

Гидрокортизон

Инсулин

Физраствор а затем помещают препарат в защитную среду, дополнительно содержащую глюкозу, гидрокортизон, инсулин при следу оцем количественном соотношении компонентов,

Глицерин

Сыворотка крови

Глюкоза

Гидрокортизон

Инсулин

Среда 199

120-180 150-200

45-50 0,05-0,07

50-70 ЕД До 1000 мл

Изобретение может быть использовано в нейрохирургии. Цель изобретения - повышение жизнеспособности препарата. Производят инъекцию сосудов нерва раствором, содержащим диме- тилсульфоксид, глюкозу, гидрокортизон, инсулин и физраствор. Затем помещают препарат в защитную среду с глицерином, сывороткой крови, глюкозой, гидрокортизоном, инсулином и средой 199. Нервы переносят в контейг нер,, заполненный средой того же сост тава. Контейнер герметизируют и помещают в жидкий азот. Использование таких аллонейтротрансплантатов позволит восстановить чувствительность и двигательную функцию в зоне, иннервируе- мой поврежденным нервом. с (Л