Способ определения термостабильного @ -экзотоксина BacILLUS тнURINGIеNSIS Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/02 

ьо

Изобретение относится к области микробиологии и биохимии, в частности к способам получения и очистки биологически активных веществ из микробиологического и другого вида сырья.

Цель изобретения - повьшение точности и ускорение способа.

Культуральную жидкость, содержа- щую fi -экзотоксин, пропускают через диализную мембрану с последующим электрофорезом в потоке буфера, содержащего 0,01-0,015 М фосфат, рН 7,0-8.,О, при плотности тока 0,1- 0,12 А/см, времени разделения 150- 200 с и скорости подачи фильтрата 0,02-0,05 см/с. При этом после пропускания культуральной жидкости че- рез диализную мембрану с помощью ультрафильтрационной ячейки -экзотоксин освобождается от клеток и высокомолекулярных компонентов свьше 1000 дальтон. Затем фильтрат подвергают дальнейшему разделению в элек™ трофоретической камере. В результате последовательного использования этих методов удается выделить пик, содержащий чистый -экзотоксин. Концентрацию экзотоксина определяют по ка- либровочной кривой поглощения на длине волны 260 нм в кювете с оптически путем 10 мм. ,

На фиг. 1 показана принципиальная схема выделения р -экзотоксина из культуральной жидкости;- на фиг. 2 - график распределения вещества после электрофореза в свободном потоке на выходе из камеры разделенияj на фиг. 3 - зависимость оптической плоТ ности от концентрации р -экзотоксина

Устройство для вьщеления р -экзотоксина содержит ультрафильтрационную ячейку 1, диализную мембрану 2 баллон 3 с сжатым газом, проточную электрофоретическую камеру 4, элек- тродные отделения 5, коллектор 6 с набором пробирок и емкость 7 для несущего буфера.

П р и м е р. Через ультрафильтра- 1Ц1ОННУЮ ячейку 1 с диализной мембра- ной 2 площадью 5 см пропускают куль туральную жидкость. Фильтрацию проводят с помощью баллона 3 со сжатым азотом при давлении порядка 6-7 атм, Объемная скорость фильтрации при это составляет 0,01 . При скорости фильтрации 0,02 получают аналогичный результат, С э той же ско . ростью фильтрат подают в электрофоре

0 5 Q

5

5

0 5

0

тическую камеру 4, в которой через электродные отделения 5 от источника питания подается постоянное электрическое напряжение. При этом в камере протекает электрический ток с плотностью 0,1 А/см, что обеспечивает оптимальное выделение экзотоксина из фильтрата при времени разделения 2,5 мин. Аналогичный результат получают при плотности тока 0,12А/см. В качестве электрофоретический камеры используют ячейку с размерами 300«60кО,5 мм.

Несущий буфер 0,01 М триэтанол- аминфосфат с рН 7,5 непрерывно подается в рабочий зазор камеры из емкости 7, Образец (фильтрат культуральной жидкости) и поток несущего буфера непрерывно отбирается на выходе из камеры с помощью коллектора 6 с набором пробирок. После отбора фракций по 2 мл в отдельные пробирки с помощью спектрофотометра в кювете толщиной 10 мм на длине волны 260 нм определяют распределение оптической плотности вдоль электрического поля камеры . На фиг. 2 показан результат распределения вещества после электрофо- в свободном потоке на выходе из камеры разделения. Стрелкой указано (место ввода образца в камеру. Из- рисунка видно, что вещество на выходе из камеры распределено в виде трех пиков, имеющих разное отклонение в электрическом поле и отличающихся по ЭФП.

С помощью метода тонкослойной хроматографии (тех) на пластинках Silu- fol установлено, что третий пик на кривой распределения оптической плотности соответствует чистому р -экзотоксину, следовательно, экзотоксин имеет максимальную ЭФП в сравнении с остальными компонентами фильтрата.

Получаемый препарат -экзотоксина электрофоретически и хроматографи- чески чист и не содержит примесей. Специальные биологические тесты показывают также, что вьщеленный препарат экзотоксина обладает биологической активностью. По суммарной величине поглощения в третьем пике и с использованием калибровочной кривой поглощения в кювете 10 мм на длине волны 260 нм для чистого В -экзотоксина определяют концентрацию экзотоксина в пике с точностью ±10% (фиг. 3).

Для данного случая концентрация -экзотоксина составляет 0,045 мг/мл.

Предлагаемый способ выделения позволяет повысить выход термостабильного р -экзотоксина до 98-99% вместо 50-30% по известному способу, повысить точность количественного бпреде- ления -экзотоксина в культуральной ю жидкости до ±10% вместо 50% и сокра- тить в два раза минимальное время, необходимое для определения экзотоксина (до 20 мин). Указанное время можно уменьшить до 5 мин, если исполь-15 зовать на выходе из камеры разделения проточную кювету спектрофотометра объемом 0,1-0,2 см.

Формула изобретения

Способ определения термостабильного -экзотоксина Bacillus thurin- giensis путем очистки культуральной жидкости с последующей идентификацией и спектрофотометрией, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности и ускорения способа, очистку проводят ультрафильтрацией через диализную мембрану с последующим электрофорезом в свободном потоке буфера, содержащего 0,01- 0,005 М фосфат рН 7,0-8,0 при плотности тока 0,1-0,12 А/см, времени разделения 150-200 с и скорости подачи фильтрата 0,02-0,05 см/с.

Изобретение относится к микробиологии и биохимии, точнее к способам получения и очистки биологически активных веществ из микробиологического и другого вида сьфья. Цель изобретения - повьшение точности и ускорение способа. Для этого культу- ральную жидкость, содержащую -экзотоксин, пропускают через диализную мембрану с последующим электрофорезом в потоке буфера, содержащего 0,01-0,015 М фосфат, рН 7,0-8,0, при плотности тока 0,1-0,12 А/см, времени разделения 150-200 с и скорости подачи фильтрата 0,02-0,05 см/с. После пропускания культуральной жидкости через диализную мембрану с помощью ультрафильтрационной ячейки, -экзотоксин освобождается от клеток и высокомолекулярных компонентов свыше 1000 дальтон. Фильтрат далее разделяют в электрофоретической камере, выделяя пик, содержащий чистый .р-экзотоксин. S (Л

«гя7

Оптическая пйотнобть

оюо

j.

10

V 10

Ал.

F

Miffe канала.

ол/личес/fffff ЛЛО/Л- НОСЛ71

0780о, т

о.100

0,060

0,020

и,ОЮ

Редактор Н.Яцола

Составитель А.Агуреев Техред М.Дидык

Заказ 2768/26

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

0,030

фиг.з

OfOSO /(онце/ /г/рпи я

Корректор В.Бутяга

Подписное